藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。     

菰黑粉菌MAPKK同源基因UeMkk1的全长克隆及表达

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是菰(Zizania latifolia)植株体内的内生真菌,其二型态转换与茭白孕茭密切相关,而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)途径在真菌二型态转换中具有重要调控作用.本研究利用酵母型及菌丝型菰黑粉菌的差异蛋白表达及转录组分析数据,克隆了菰黑粉菌中一个丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase,MAPKK)基因UeMkk1(GenBank登录号:KR870332).该基因cDNA序列全长2 204 bp,开放阅读框2 043 bp.与模式菌酵母的MAPK途径蛋白进行聚类分析表明,UeMkk1属于MAPKK蛋白,NCBI中Blast比对结果及进一步的系统发育分析表明,UeMkk1与黑粉菌属真菌的Mkk1同源性较高,其中与大麦坚黑穗病菌(Ustilago hordei)的MKK1一致性达到84％,其丝/苏氨酸双特异性蛋白激酶催化结构域在不同真菌中高度保守.同时,本研究通过大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统成功表达并从蛋白裂解上清液中纯化得到了纯度较高的UeMkk1蛋白.另外,对不同碳源诱导后菰黑粉菌的生长特征观察及UeMkk1的表达分析表明,蔗糖能诱导菰黑粉菌菌丝的形成及生长,UeMkk1的表达量在菌丝生长后期下调表达;PDA、葡萄糖及麦芽糖培养基中菰黑粉菌保持酵母型生长,UeMkk1呈周期性上调表达.以上研究工作为进一步开展UeMkk1基因的功能研究,阐明其在菰黑粉菌二型态转换及茭白孕茭中的作用提供了基础材料.     

平榛MAPKK基因克隆及在非生物胁迫下的表达分析

通过研究外界刺激信号对平榛中促分裂原活化蛋白酶途径的影响,探索该途径中MAPKK类基因对各种非生物胁迫的响应机制。根据平榛花芽转录本高通量测序的结果,采用RACE-PCR方法克隆到一个平榛MAPKK基因,全长1 065bp,推断其编码354个氨基酸,命名为Ch MAPKK2。序列分析表明,该基因含有MAPKK类型基因典型的磷酸一致化序列SLADIDS。构建的系统发育树结果表明,它与葡萄Vv MAPKK2以及苹果Md MAPKK的亲缘关系较近,相似性分别为81.69%和78.53%。采用qRTPCR,以ACTIN为内参对Ch MAPKK2基因在自然条件下花芽部位的表达模式进行分析,结果表明:在自然条件下从11月份到次年4月份Ch MAPKK2的表达量呈现先上升后下降的趋势;对平榛根蘖苗进行4℃、干旱及盐胁迫处理,发现Ch MAPKK2基因均受上述3种非生物胁迫的诱导而上调表达;Ch MAPKK2在不同器官中的表达具有组织表达特异性,雌花芽中表达量最高,其次是树皮,雄花序中表达量最低。上述研究结果表明Ch MAPKK2基因在平榛适应非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。     

植物丝裂原活化蛋白激酶激酶的生物信息学分析

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导通路是植物细胞内重要的信号传导系统,在多种生物和非生物胁迫,激素、细胞分化和发育进程中发挥关键作用。丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)是信号传导中的重要成员,执行整合上游信号到丝裂原活化蛋白激酶的重要功能。基于BLAST搜索,得到植物丝裂原活化蛋白激酶激酶基因序列。采用CLUTALW、SMART、SwissModel和MEGA3,1软件分析这些序列。多序列比对揭示了它们具有典型的蛋白激酶ATP结合域签名和丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶激活位点签名。空间结构预测表明它们与人MAPKK的晶体结构相似。系统进化树中烟草和番茄的丝裂原活化蛋白激酶激酶、野生稻和印度栽培稻丝裂原活化蛋白激酶激酶形成独立的分支,说明它们分别具有较近的亲缘关系。