蚓激酶成熟肽的原核表达及纯化

应用PCR技术扩增获得蚓激酶成熟肽基因，并按相应的阅读框架克隆入表达载体pGEX-4T中谷胱甘肽S-转移酶（GST）的下游。重组质粒转化大肠杆菌Rosetta株，分别在1．0mmol／LIPTG、37℃和0．1mmol／L IPTG、28℃条件下诱导，蚓激酶成熟肽-GST融合蛋白获得了高效表达，且后者得到了可溶性蛋白。经SDS-PAGE证实所表达的融合蛋白产物相对分子量与预期的53kD相符。并且以等电点和亲和层析的方法对表达出的可溶性蛋白进行了纯化。     

蚓激酶基因在大肠杆菌中的表达

[目的]实现蚓激酶基因在大肠杆菌中的高效表达。[方法]采用RT-PCR技术,以含蚓激酶基因的质粒pMD18-Tf3为模板进行RT-PCR扩增,克隆了蚓激酶基因Tfc,并进行测序,之后将蚓激酶基因Tfc克隆到大肠杆菌表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,用LB培养基于30℃培养24 h后,然后调温至42℃继续培养2 h诱导蚓激酶基因表达,收集菌体,进行SDS-PAGE电泳,利用纤维平板法检验蚓激酶的活性。[结果]测序发现该基因全长729 bp,共编码243个氨基酸,GenBank登录号为EU167735。SDS-PAGE电泳表明诱导表达后菌体总蛋白在28 kD处有一特异性条带,而含空质粒pBV220的大肠杆菌经诱导表达后无该条带,表达蛋白主要以包涵体形式存在,无纤维蛋白酶活性。[结论]该研究为创新蚓激酶的生产工艺提供了依据。     

蚓激酶F-Ⅲ-1基因植物表达载体的构建

[目的]探讨蚓激酶F-III-1基因在烟草中的高效表达。[方法]以经烟草密码子优化、人工合成的蚓激酶成熟肽F-III-1为目的基因,以p CAMBIA3301和p BA002质粒为基础,构建由35S启动子调控、抗草铵膦基因(bar)为选择标记的植物表达载体。[结果]成功构建了4个植物表达载体,分别是p CAMBIA3301-F-III-1、p CAMBIA3301-F-III-1-6x His、p BA002-F-III-1和p BA002-F-III-1-6x His。[结论]4个植物表达载体的成功构建为探讨蚓激酶在植物中的表达及其植物反应器生产奠定了基础。