毛尖紫萼藓GpAPX的克隆和信息学分析及其在植株干旱与复水下的表达分析

以毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)为试材,采用RACE技术克隆获得1个抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)的cDNA序列,命名为GpAPX(GenBank登录号:GU989311)。该基因全长1 115 bp,编码区为771 bp,编码256个氨基酸,5’非翻译区为116 bp,3’非翻译区为228 bp。序列分析表明:该基因属于过氧化物酶基因家族,与其他植物抗坏血酸过氧化物酶的同源性为70.2%～89.7%。实时定量PCR检测结果显示,GpAPX在干旱及复水条件下均能表达,表明GpAPX蛋白可能与抗旱性相关,在毛尖紫萼藓响应干旱胁迫过程中发挥作用。     

两种紫萼藓科植物的POD和SOD同工酶分析

POD和SOD同工酶分析结果表明:分布于五大连池的毛尖紫萼藓和东亚砂藓中,东亚砂藓遗传多样性较贫乏,毛尖紫萼藓之间具有显著的遗传差异,东亚砂藓与毛尖紫萼藓属间遗传差异显著。     

毛尖紫萼藓类泛素蛋白基因的克隆与表达分析

为研究类泛素蛋白基因在苔藓植物中的生物学功能,从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得了类泛素蛋白基因cDNA全长序列,命名为Gp-UBL5。该基因cDNA全长471 bp,包含1个222 bp的完整开放阅读框,编码73个氨基酸组成的蛋白。生物信息学分析表明,Gp-UBL5基因编码蛋白分子质量为8.525 kDa,等电点为7.84,为稳定型蛋白。进化分析显示,该编码蛋白与二穗短柄草、大麦等类泛素蛋白具有较高一致性,达96%~99%。实时荧光定量PCR结果表明,Gp-UBL5基因在复水和快速干旱的各个时期均有表达,推测该基因可能在毛尖紫萼藓的抗旱机制中发挥作用。     

应用GIS预测砂藓属与紫萼藓属在中国的分布范围

紫萼藓科(Grimmiaceae)是典型的多年生旱生藓类,我国有紫萼藓属(Grimmia)22种、砂藓属(Racomitrium)23种.本文利用我国紫萼藓属172个、砂藓属180个地理分布记录,以及对应分析区的年均降雨量和年均温度数据,建立了这两个气候因子影响砂藓属和紫萼藓属种数分布的数学模型.发现砂藓属种数分布(Y)与年均降雨量(X1)符合y=0.070 38+0.000 097 6X1-0.000 000 017X21(R=0.191 6,P＜0.05),与年均温度(X2)符合Y=0.119 948 +0.011 4X2-0.000 6X22 +0.000 006X32 (R=0.1604,P＜0.1);紫萼藓种数分布(Y)与年均降雨量(X1)符合Y=2.670 1X1-0.439 6(R =0.301 6,n=171,P＜0.01),与年均温度(X2)符合Y=0.216 4-0.007 4X2 (R=0.333 8,n=171,P＜0.001).在此基础上,应用地理信息系统(ArcGIS 9.3),直观地展示了砂藓属与紫萼藓属植物在我国潜在的地理分布范围,发现砂藓属在我国浙江、台湾、贵州、湖北、云南、重庆、江苏等地具有较高的分布概率,表现出热带性的分布特点;紫萼藓属在我国浙江、台湾、云南、江苏、辽宁等地分布较高,表现出温带性的分布特点.     

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质双向电泳体系的建立

为开展毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)的蛋白质组学研究,本研究对毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质提取方法和双向电泳参数进行了筛选和优化,以期建立适合毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳的实验体系。分别采用Tris-酚抽提法和TCA-丙酮法对毛尖紫萼藓总蛋白质进行提取,比较分析了两种蛋白质提取方法的效果,并研究了IPG胶条的pH范围及蛋白质电泳上样量等因素对毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳结果的影响。结果发现,在SDS-PAGE电泳结果中,与TCA-丙酮法相比,Tris-酚抽提法提取的蛋白质条带清晰,数目较多,完整性较好;在双向电泳结果中发现,与pH值为3~10的IPG胶条相比,使用pH值为4~7的IPG胶条的双向电泳图谱蛋白质点清晰且分布均匀,更适合毛尖紫萼藓的蛋白质组学分析;使用24 cm的pH值为4~7胶条,上样1200μg蛋白质时,电泳结果中可分辨的蛋白质点最多,且形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。本研究基于Tris-酚抽提法建立的毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳体系获得的蛋白质样品质量好,电泳分辨率高,为毛尖紫萼藓进一步的蛋白质组学研究提供理论参考。     

低温胁迫下紫萼藓科植物保护酶活性的变化

低温胁迫试验结果表明,东亚砂藓与毛尖紫萼藓的过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）对低温的适应机制不同,东亚砂藓的POD活性比毛尖紫萼藓的变化幅度大,而毛尖紫萼藓的SOD活性比东亚砂藓的变化幅度大。而且均表现为处理前期活性变化幅度较大,低温胁迫处理的酶活性要高于对照;后期则趋于平稳,与对照差异较小。     

毛尖紫萼藓配子体再生体系的建立

以消毒试验后所得的毛尖紫萼藓原丝体为材料,通过培养,成功的建立了毛尖紫萼藓配子体再生体系。结果表明:MS培养基、低pH能促进毛尖紫萼藓原丝体褐化;葡萄糖能诱导出弱小的配子体;激素对毛尖紫萼藓配子体诱导效果不理想;NH4NO3浓度为2.5g/L的Prat培养基,适合于毛尖紫萼藓原丝体分化成配子体;将褐化到一定程度的原丝体接种到Prat培养基后,20d可以生长出较理想的配子体。     

毛尖紫萼藓GH394基因克隆、表达载体的构建

利用PCR技术,以毛尖紫萼藓总RNA为模板,扩增出上、下游分别加入BamHI、SacⅠ酶切位点的GH394(657 bp)基因CDS区全长序列,采用pMD18-T Vector、pRI 101-AN Vector构建了该基因克隆、表达载体,并将重组载体质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)工程菌株GV3101中,并选用X-gal、IPTG和利福平(Rifampicin,Rif)、卡那霉素(Kanamyein,Km)筛选阳性菌株。结果表明:已成功构建pMD-GH394克隆载体和pRI 101-AN-GH394表达载体并将重组质粒转入目的菌株中;该试验为后续实现毛尖紫萼藓GH394基因抗旱预期功能的验证,奠定了良好的试验基础。