Effects of wood char and activated carbon on the hydrolysis of cellobiose by β-glucosidase from Aspergillus niger

Biochar amendments to soils have been suggested as a strategy to sequester carbon and therefore mitigate global climate change. The enrichment of soils with charred materials also increases their fertility. This fertilising effect of biochar may be caused by various mechanisms; an acceleration of nutrient cycling has been suggested as one such mechanism. The rate-limiting step in nutrient cycling is thought to be the extracellular enzymatic attack on biological macromolecules. In this study, therefore, the effects of chestnut wood char (specific surface area 2.0 m² g⁻¹) and of activated carbon (specific surface area approximately 900 m² g⁻¹) on an extracellular enzymatic reaction involved in the degradation of cellulose (i.e., hydrolysis of cellobiose by β-glucosidase from Aspergillus niger) were investigated. Cellobiose was not adsorbed by chestnut wood char, whereas activated carbon absorbed more than 97% of it. Both charred materials adsorbed more than 99% of β-glucosidase. For chestnut wood char, adsorption of the enzyme caused a decrease of approximately 30% in the reaction rate, whereas for activated carbon, the nearly complete absorption of both substrate and enzyme entirely inhibited the reaction. These results show that β-glucosidase from A. niger retains most of its activity when adsorbed to chestnut wood char and that the reaction it catalyses in nature is only slightly affected by this charred material. On the other hand, a material characterised by a high specific surface area and high porosity, such as activated carbon, can make even a highly soluble substrate unavailable for soil enzymes and therefore completely inhibit the reaction. Thus, charred materials may affect nutrient cycling mainly by regulating the availability of substrates: the degradation of highly soluble substrates may be accelerated by materials with low specific surface area, which maintain an active and protected enzyme pool, whereas materials with high specific surface and high porosity may slow down the degradation by making substrates unavailable.     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属（Aspergillus sp.）的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/（min·mg）,最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

产低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

对低温淀粉酶资源的开发是功能酶研究的新热点,本研究从东帕米尔高原江布拉克冰川冻土中分离获得多株高产低温淀粉酶菌株,最高产酶菌株D5-2经16S rDNA鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌.对D5-2所产淀粉酶性质进行初步分析,结果表明,其最适作用温度和pH值分别为25 ℃和6.5,酶的热稳定性较差,40 ℃处理1h后酶活急剧下降,至70℃酶活力仅存23％;在pH 5.5～8.0条件下,酶活力相对稳定;Mn2+和Mg2+对淀粉酶有激活作用,而乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、Fe2+和Na+则抑制酶活.结果提示,菌株D5-2分泌的淀粉酶符合低温酶特性,应用空间较大,值得深入探究开发.     

普鲁兰酶氮端氨基酸的截短对其酶学性质的影响

淀粉是丰富的生物质资源,已被广泛地应用到食品、酿酒、医药等各个相关的领域.普鲁兰酶(pullulanase,pulA,EC 3.2.1.41)作为淀粉脱支酶,可以水解淀粉中的α-1,6糖苷键,最大限度地降解淀粉原料,提高淀粉利用率.因此,寻找一条国产化的道路开发我国自己的普鲁兰酶,具有长远的意义.课题组前期从淀粉厂附近的土壤中筛到一株普鲁兰酶的高产菌株变栖克雷伯氏菌(Klebiella variicola)strain 7,克隆获得pulA基因(GenBank登录号:KJ146839.1)后在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中异源表达.为提高该蛋白的表达量和分泌效率,同时改善普鲁兰酶的性质,本研究利用基因工程的手段构建了普鲁兰酶去信号肽突变体M1和氮端31个氨基酸的截短突变体M2,结果显示M1和M2最适温度均为45 ℃,二者的最适pH分别是6.0和5.6;M2的半衰期是37 min,是M1的6.17倍;M2的比酶活是582.204U/mg,是M1的1.6倍.动力学分析显示,以普鲁兰糖为底物时,M2的Vmax、Kcat、Km和Kcat/Km分别为0.001 3μmoL/(mL·s)-1、191.80-1 s.-1、0.30 mg/mL、693.30,与M1相比,M2的底物亲和能力增加,同时催化效率是M1的2倍.本研究通过普鲁兰酶氮端氨基酸的截短,为提高酶的比酶活和半衰期提供了新的方法和思路.     

辐照预处理促进玉米秸秆酶解糖化

以~(60)Co为辐照源,研究了0～2 000 kGy不同辐照剂量处理对玉米秸秆水解及酶解还原糖产量的影响,采用DNS法测定样品中水溶性还原糖的含量,探讨了辐照剂量与还原糖生成量的关系。结果表明,较高剂量的辐照对玉米秸秆有明显的降解糖化作用,经1200,1600,2000kGy剂量辐照后,玉米杆和玉米叶的还原糖含量分别提高了69.88%和445.63%;辐照后玉米秸秆易于酶解,随着辐照剂量的增大,酶解产糖量显著增加;在较高剂量下,辐照一酶解复合降解玉米秸秆效果优于单一的辐照处理和单一酶处理;辐照后的玉米秆和玉米叶经酶解处理,其还原糖含量分别增加了16.63%～184.13%和8.49%～228.45%,提高了纤维素原料的利用率。     

水稻OsUAP2基因生物信息学分析及原核表达活性鉴定

UAGPase广泛存在于生物体,是糖代谢过程中一类重要酶。我们前期发现水稻Os UAP1具有单向催化UDPG分解代谢活性,Os UAP2与Os UAP1序列相似性极高。本研究对Os UAP2进行生物信息学分析,构建并表达重组蛋白,并鉴定其酶蛋白活性。结果表明,OsUAP2基因位于4号染色体,编码区序列长1482 bp,编码493个氨基酸;Os UAP2具有UDPGP保守结构域,无跨膜区域,N-端不含信号肽;二级结构分析显示,该蛋白含α-螺旋和无规则卷曲较多;同源性分析表明,Os UAP2与玉米UAGPase的亲缘关系最近。在16℃下经0.1 mmol/L IPTG诱导8 h,原核菌株BL21表达出分子量约55 kD可溶性重组蛋白。体外酶活性测定表明,Os UAP2能同时催化UDPG降解和合成,表现出双向可逆催化的特点。本研究结果为进一步深入研究OsUAP2基因的生物学功能提供了科学依据。     

酶解油菜蜂花粉抑制超氧阴离子自由基的研究

【研究目的】探讨油菜蜂花粉中水溶性有效组分的抗氧化能力及其在黄嘌呤氧化酶体系中抑制O2-.的机理。【方法】采用酶解技术和膜分离技术提取分离油菜蜂花粉中水溶性抗氧化有效组分,用黄嘌呤氧化酶体系测定酶解物的不同相对分子质量级分淬灭超氧阴离子自由基(O2-.)的能力。【结果】实验结果表明,经酶解和超滤后得到的相对分子质量大于1000的组分抑制O2-.的效果非常显著【结论】酶解和膜分离技术是提高花粉抗氧化功效成分含量的有效途径。     

植物低聚糖提取和生物活性鉴定

应用酶解法从小麦细胞壁中提取出低聚糖。经过活性鉴定,具有诱导大豆和小麦抗毒素产生,特别是从小麦代谢、细胞、植株等水平上改善该作物体内防御功能等生物作用。水解酶的种类、纯度、酶活值与所降解低聚糖的活性程度密切相关;高纯度、高酶活单位的水解酶提取的低聚糖,具有较强的生物功能。对来源不同的低聚糖进行了活性差异的比较,同时还讨论了其它因素——诸如小麦细胞的生理状态,低聚糖保存条件等对低聚糖活性的影响。     

棉花纤维中木质素的相对分子量

分子量是聚合物的重要特性之一,木质素的分子量及其分布是研究苯丙烷类结构的反应、物理化学特性和评价其改性产物质量的内容之一。本研究以陆地棉TM-1成熟纤维为材料,分别利用酶解-温和酸解木质素法和二氧六环法提取棉纤维中木质素,结合凝胶渗透色谱法(gel permeation chromatography,GPC)调查和评价2种方法获得的棉纤维中木质素的相对分子量。结果表明,经二氧六环处理提取的棉花纤维中的木质素(dioxane lignin,DL)的重均分子量为2924g mol~(–1)、数均分子量2403 g mol~(–1),略高于由酶解-温和酸解处理提取的木质素(enzymatic hydrolysis-mild acidolysis lignin,EMAL)的重均分子量(2169 g mol~(–1))和数均分子量(1970 g mol~(–1)),EMAL的多分散系数稍低,说明木质素的均一性比DL高。表明EMAL法提取的木质素更适用于分析棉纤维中木质素的相对分子量。利用EMAL法分析棉纤维中木质素相对分子量表明,不同棉花品种的木质素重均分子量分布范围为938~2169 g mol~(–1),数均分子量分布范围为857~1970 g mol~(–1),多分散性系数在1.09~1.74间,均小于2。重均分子量与纤维马克隆值呈显著负相关,数均分子量与纤维长度呈显著负相关,与纤维马克隆值呈极显著负相关。     

花生乳状液体系中蛋白质的酶解动力学研究

采用碱性蛋白酶Alcalase 2.4L水解花生乳状液体系中蛋白质,研究了蛋白酶在乳状液体系中的水解特性。结果表明：蛋白质水解度随着初始酶浓度的增加而提高,在酶浓度一定的情况下水解度随着初始底物浓度的提高而降低。蛋白质水解度与乳状液的破乳率存在显著正相关(r=0.983)。在花生乳状液体系中Alcalase 2.4L的水解动力学参数Km=0.0698mol/L,Vmax=3.71×10-4mol/(min·L)。由实验数据推导出蛋白质酶解初级阶段的动力学方程,确定蛋白质水解和乳状液破乳的临界初始底物质量浓度为8.73g/L（加酶量为0.05%）。在酶和底物初始浓度以及反应时间确定的前提下,通过动力学方程可预测破乳过程中蛋白质的水解度及破乳率。