BPA不影响卵母细胞减数分裂相关基因Dazl的甲基化

为了探讨环境雌激素BPA对小鼠卵母细胞减数分裂相关基因Dazl甲基化的影响,本研究通过给孕鼠饮用含有BPA的水方式使胎鼠在发育过程中接触BPA,利用重亚硫酸盐测序法,分析了胎鼠生殖嵴卵母细胞不同发育时期Dazl甲基化水平的变化。结果显示:Dazl在减数分裂期间处于低甲基化水平,无论对照组或处理组均低于10%,说明Dazl的低甲基化对维持减数分裂的正常进行有重要作用;对照组与处理组的甲基化水平相当,差异不显著,说明本研究的BPA浓度不影响卵母细胞Dazl的甲基化水平。     

Dazl基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系的研究

本文旨在探讨Dazl基因与犏牛雄性不育的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Dazl基因mRNA表达并进行分析。结果表明:三种牛中Dazl基因在睾丸组织中特异表达,且犏牛睾丸组织中表达量最低,其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著(P<0.05),犏牛与牦牛差异不显著(P>0.05)。结果提示,Dazl基因在三种牛睾丸组织特异表达,说明Dazl基因在细胞周期运行中发挥作用,Dazl基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关。     

小鼠 Dazl 基因真核表达载体的构建及表达检测

为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RT-PCR方法,从13．5 dpc 雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pcDNA3．1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot 技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。     

青鱼Dazl基因的原核表达及其多克隆抗体制备

实验进行了青鱼( Mylopharyngodon piceus ) Dazl 基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼 Dazl 基因的编码区利用重组表达引物从pCS2- MpDazl 质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a- MpDazl 重组表达载体。然后将pET-28a- MpDazl 重组质粒转化至大肠杆菌( Escherichia coli )BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和 Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a- MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37 ℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。     

小鼠DAZL基因启动子核心区域分析及甲基化对其启动活性的影响

旨在确定小鼠DAZL启动子基本活性区,并分析启动子区域甲基化对其启动子活性的影响,探究小鼠DAZL的表达调控机制。采用PCR法扩增不同长度的小鼠DAZL启动子,插入到p EGFP-N1和p GL3-Basic载体,构建重组载体。将重组载体转染GC-1细胞系,并通过添加适量DNA甲基化转移酶抑制剂(5-azacytidine,5-aza-C)逆转各试验组启动子片段的甲基化水平,然后利用双荧光素酶报告基因检测系统检测DAZL活性变化。双荧光素酶活性检测结果表明,小鼠Dazl启动子基本活性区域为5’侧翼区-370~-36 bp,在-370~-166 bp区域存在不可或缺的重要调控元件;经5-aza-C处理后,各缺失片段载体转染的GC-1细胞DAZL的启动子活性与对照组相比均有不同程度的提升,但差异不显著。本试验确定了小鼠DAZL启动子基本活性区域,证明降低小鼠睾丸DAZL启动子区域甲基化水平,有助于DAZL在生殖细胞中特异性表达,为进一步探究DAZL生物学功能和调控机制提供参考。