水稻质体多顺反子表达载体的构建及其对烟草质体的转化

【目的】尝试水稻质体多顺反子定点整合表达载体转化到烟草质体中表达。【方法】根据已发表的相关序列，分别设计引物，通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件：质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子（Prrn）、质体psbA基因3′端终止子（psbA3′）、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因（aadA）、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG，大小3362 bp)，命名为crDNA、甘露聚糖酶基因（man）、绿荧光蛋白基因（gfp）。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS -man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′- trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片5枪，用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选。【结果】获得质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Western blot等方法检测都证实man、gfp、aadA三个基因且均得到表达，用RFLP证实表达盒整合到烟草质体基因组中。【结论】水稻质体多顺反子定点整合表达载体已整合到烟草质体基因组中，并得到表达。     

番茄质体多顺反子定点整合表达载体的构建及其转烟草的研究

根据烟草叶绿体高频同源重组片段的已知序列(GenBank Z00044.1)设计引物,用PCR的方法克隆到1个3.663 kb的番茄叶绿体DNA片段（psbD/trnG）,命名为ctDNA。该片段与GenBank中烟草的相应片段有96.7%同源性, 与本文所用的烟草的相应片段有95.8%同源性。以其为外源多顺反子定点整合介导的同源重组片段,与来自烟草叶绿体的强启动子Prrn和终止子psbA3’,以及甘露聚糖酶基因man、绿荧光蛋白基因gfp、氨基糖苷3’-腺苷酰基转移酶基因aadA构建番茄质体多顺反子定点整合表达载体pLM2(-psbD-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3’-trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草3株。用PCR、激光扫描、Western Blot、RFLP等方法检测都证实man、gfp、aadA基因已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达。用番茄质体多顺反子定点整合表达载体成功实现在烟草质体中的表达。     

Transgene Homozygosity Following Particle Bombardment of Haploid Barley Microspores

Information from previously published studies that are basic to this study is： 1） Following isolated barley microspore culture, around 80% of the resulting barley plants are completely fertile and genetically homozygous doubled haploids （DH） （Kasha et al., 2003）. 2） Chromosome doubling occurred during early stages of microspore culture, mainly by nuclear fusion （Kasha et al., 2001）. 3） A fairly synchronous population of microspores was selected to determine the cell cycle stages （G1, S, G2） by relative DNA density measurements （Shim and Kasha, 2003a）. 4） The pretreatments of spikes used to induce microspore embryogenesis influenced the cell cycle progression during pretreatment. （i） Using a combination of cold （4℃） and 0.3 mol/L mannitol for 4 days, the microspores were held at the G1 uninucleate stage. （ii） The often used pretreatment of cold （4℃ for 21 to 28 d） permitted slow microspore stage progression so that most cells were at the G2 stage or had become binucleate by the end of the pretreatment. （iii） Pretreatment with mannitol for 4 days at 25 ℃ did not block cell cycle progression but prevented cell wall formation after the 1^st mitotic division, leading to nuclear fusion and chromosome doubling.     

基因枪转化小麦主要轰击参数的优化

基因枪转化是目前小麦遗传转化的主要方法。影响基因枪转化效率的主要参数有轰击距离、轰击压力、DNA总量及浓度、金粉颗粒大小及用量等。为改善目前小麦遗传转化效率偏低的现状, 以普通小麦品种科农199为受体材料, 设金粉大小(0.6 μm和1.0 μm)、轰击距离(5.5 cm和8.5 cm)及轰击压力(650、900和1100 psi)三因素共12个处理, 利用pAHC25质粒转化小麦幼胚, 以确定最佳轰击参数, 建立稳定高效的普通小麦基因枪转化体系。结果表明, 3个因素的不同组合对幼胚的愈伤诱导效率没有明显影响, 但对再生率影响较大, 以金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm的再生率最高。3个因素组合的不同处理对GUS瞬时表达有明显影响, 以金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm和轰击压力650 psi处理的GUS瞬时表达量最高。本试验最终获得28株转基因植株, 其中12株来自金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm和轰击压力650 psi的处理, 该处理的平均转化率达2.66%。     

小麦成熟胚基因枪转化影响因素的研究

为了探索小麦成熟胚基因枪转化的影响因素,对Z50、郑麦366、Bobwhite和西农529四个小麦基因型的成熟胚进行了愈伤组织的诱导及植株分化再生研究,同时以郑麦366的成熟胚为外植体分析了不同渗透处理剂、每枪金粉用量和轰击距离对基因枪转化过程的影响。结果表明,Z50、郑麦366、Bobwhite三个基因型的出愈率及胚性愈伤率差异不大,均在85%以上,西农529的出愈率较低,胚性愈伤率与Z50、郑麦366和Bobwhite差异显著。不同小麦基因型分化率差异显著,其中郑麦366分化率最高(39.26%)。基因枪转化结果显示,渗透剂对小麦愈伤组织生长均有一定的抑制作用,蔗糖的抑制作用比甘露醇弱;每枪金粉用量100μg的分化率较高(45.57%),但金粉用量100μg时的GUS瞬时表达量与金粉用量60μg时差异不显著,轰击距离为9cm时的分化率和GUS瞬时表达量均比6cm和12cm时高;蔗糖用量0.4mol、金粉用量60μg、轰击距离9cm时GUS瞬时表达量最高,该条件下小麦成熟胚转化频率达0.67%,已初步优化了基因枪介导的小麦成熟胚遗传转化体系。     

Transformation of Coat Protein Encoding Gene from Soil-Borne Mosaic Virus into Wheat

CWMV-CP1 target gene and bar selection gene were co-transferred into commercial wheat vari-ety of Yangmai158 by particle bombardment. In total, 145 resistant plants to 3 - 5 mg L-1 Bialaphos were ob-tained, 21 plants were identified to be positive in T0 generation by PCR-Southern test, and the transformationfrequency had 0. 99%. T1 plants were further tested by PCR and Southern hybridization. Results demonstra-ted that the alien resistance gene had been integrated into the wheat genome. The segregation ratio of CP1+ toCP1- in T1 generation was 1.0 to 1.3, and didn't agree with Mendelian rule. RT-PCR result from T2 plantsshowed that the alien gene CWMV-CP1 had stable expression in wheat genetic background.     

蔗糖在小麦基因枪法转化体系中的应用

构建植物表达载体并利用该载体与含有选择压力基因的载体对小麦幼胚愈伤组织进行共转化。比较分析了高渗透压处理阶段使用0.4 mol/L的蔗糖（合12％）代替甘露醇及恢复培养阶段使用过渡浓度的蔗糖（6％,介于高渗透压培养基中蔗糖的浓度12％和分化培养基中蔗糖的浓度3％之间）对分化率和转化效率的影响。结果表明,在采用基因枪轰击法叶小麦幼胚愈伤组织进行转化的体系中,以蔗糖代替甘露醇进行高渗透压处理,进而使用含有较高浓度蔗糖的培养基进行恢复培养的方法简便有效,可以促进分化能力提高,转化效率可达2.1％。