BIBAC2载体转化水稻的研究

双元细菌人工染色体(BIBAC)载体具有克隆大片段DNA构建文库和农杆菌介导转化植物的双重功能.利用BIBAC载体,在双子叶植物烟草和番茄中已实现了大片段DNA的转移,但在单子叶植物中的应用还未见报道.本研究利用不同水稻基因型、不同农杆菌菌株,对水稻进行了BIBAC2载体的转化研究.水稻成熟胚诱导愈伤组织经过1~2次继代培养,在含乙酰丁香酮的N6培养基上预培养3 d,在含BIBAC2载体的农杆菌中侵染10 min,26℃下共培养3 d.感染后的愈伤组织在含25~50 mg/L潮霉素培养基上经过4~8周的筛选,共得到了66株抗性再生植株.通过对抗性植株中GUS基因的组织化学染色检测,NPTII基因的PCR检测和ELISA检测,HYG基因的PCR检测,确认2株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花15号愈伤组织,1株阳性植株来自EHA105菌系侵染的中花8号愈伤组织,转化率分别为2.9%和0.9%.结果表明,BIBAC2载体已被成功导入了水稻基因组中,转化效果EHA105菌株优于C58C1菌株,中花15号、中花8号优于中花10号和中花11号.结果还表明,利用三亲交配法可以将大于23.5 kb的载体转化到农杆菌中.初步建立了BIBAC2载体转化水稻的技术体系,为利用BIBAC系统向水稻转入大片段DNA和多个外源功能基因奠定了基础.     

野生稻细胞核DNA提取的研究

药用野生稻是中国最具利用价值的野生稻资源之一,具有许多优良的性状和有利基因,是改良栽培稻培育新品种的宝贵基因库,而其CC基因组的优良基因有望以大片段形式通过BIBAC等载体转化到栽培稻中.BIBAC文库不仅能作为大片段基因组文库的载体,而且能通过根癌农杆菌介导将克隆片段导入植物基因组直接进行转化,可用于筛选分离基因等研究.如何获得基因组DNA大片段非常关键,本研究采取 琼脂糖包埋基因组的方法获得大片段DNA,并对其中的一些步骤进行了优化,为构建药用野生稻BIBAC文库打下了很好的基础,值得在其它植物类似研究中参考.     

大片段DNA克隆载体的研究进展

DNA克隆技术是分子生物学和基因工程研究中非常重要的一项技术。自第一个质粒载体pSC101作为第一个克隆载体以来,随着分子生物学技术的迅猛发展克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。通过综述克隆载体的发展概况,以及大片段DNA文库的构建和应用,对大片段DNA遗传转化的发展做了展望。     

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有10⁴个克隆的双元细菌人工染色体（BIBAC）基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。图8参18     

云南药用野生稻BIBAC文库的构建及分析

云南药用野生稻具有许多优良性状和有利基因,其CC基因组的优良基因很难通过有性杂交转移到栽培稻(AA基因组)上,但可以通过双元细菌人工染色体(BIBAC)以大片段的形式转化到栽培稻中.利用BIBAC2载体构建了云南药用野生稻基因组DNA文库,该文库包含53 760个克隆,平均插入片段76 kb,保存在140块384孔板中...     

耐盐芦苇大片段BIBAC载体构建及水稻遗传转化

利用盐生植物的耐盐基因改良作物耐盐性是保障土壤盐渍化地区粮食生产和改良盐渍化土地的最经济最有效的途径。本研究以生长于西北盐盖上的一种耐盐野生芦苇为材料,制备了Mb级耐盐芦苇基因组DNA,酶切后经脉冲场凝胶电泳将其分离为不同大小的大片段DNA区段,并与酶切回收的BIBAC-S载体进行连接,成功构建了耐盐芦苇不同大小的大片段DNA-BIBAC载体,经根癌农杆菌EHA105介导,成功地转化了粳稻品种‘中花11’成熟胚愈伤组织,获得了转基因水稻植株。研究表明,不同大小的大片段DNA-BIBAC载体在转化同一受体材料时,其所获得的愈伤转化率、植株转化率、转基因植株的阳性率等存在差异,说明插入片段的大小与转化效率之间存在关系。本研究为创制耐盐水稻新种质、克隆盐生植物的耐盐基因提供了理论和技术参考。