橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体内黑色素合成信号通路中起关键性作用的限速酶,黑色素生成的速度和种类取决于TYR基因的表达量和活性水平.为了解色素相关基因与体色变化的关系,采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) TYR基因cDNA全序列,并利用qRT-PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中TYR基因的表达差异.实验获得cDNA全长序列2 683 bp,其中阅读框1 620bp,编码540个氨基酸,5'UTR区246 bp,3'UTR区817 bp.氨基酸序列和系统发育分析表明,相比与脊椎动物间的保守性,TYR蛋白序列在鱼类间的保守性更高.qRT-PCR结果表明,TYR基因在胚胎各期均有表达,受精期表达量最低,血液循环期开始急速上升;在“黑色-灰色-亮黄色”三个典型体色褪黑过程中,各组织TYR基因表达量均在黑色期呈现最高值,显著高于灰色和亮黄色期,灰色到亮黄色时期鳞片和尾鳍的TYR基因表达量逐渐降低,但差异不显著(P＞0.05),而皮肤组织的TYR基因表达量在三个体色褪黑期均显著降低(P＜0.05);亮黄色时期,TYR基因在心、肾、脑、鳔、性腺、尾鳍和眼等组织均有表达,其中眼部表达量最高,其次是鳔和尾鳍,皮肤和性腺表达量最低.橘色双冠丽鱼TYR基因在三个典型体色褪黑期表达逐渐降低,可能与红色素细胞和黄色素细胞逐渐增多以及黑色素细胞数量和分布比例发生变化相关.本研究通过了解体色变异的分子基础,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料.     

橘色双冠丽鱼黑素皮质素受体1基因(MC1R)整胚原位杂交

为探究黑素皮质素受体1基因(MC1R)在橘色双冠丽鱼胚胎发育和体色形成过程中的表达定位及功能,本研究首先制备了MC1R基因的RNA正反义探针,T7方向转录的正义RNA探针质量浓度为447.529 ng/μL,SP6方向转录的反义RNA探针质量浓度为342.698 ng/μL。经10～20倍稀释后的探针用于原位杂交,MC1R基因探针表达定位显示,随橘色双冠丽鱼胚胎的发育杂交信号总体呈逐渐减弱趋势,原肠期和视泡期其卵黄和胚体侧卧部分有杂交信号分布;出膜期其脊柱、卵黄囊及其内容物和色素细胞内出现杂交信号;出膜期第1天,卵黄表面有信号分布。总体来看,杂交信号在脊索、卵黄囊、卵黄囊内容物质及色素细胞有特异表达,而以正义探针作为阴性对照组在5个胚胎阶段均无任何信号,杂交信号显现的MC1R表达定位说明其在橘色双冠丽鱼色素细胞的分化、迁移中起到重要调控作用,也与神经、营养、免疫功能相关,初步建立了鱼类体色相关基因功能和定位研究的整胚原位杂交方法。     

Potential bioavailability of protein and lipids in feed ingredients for the three‐spot cichlid Amphilophus trimaculatus: An in vitro assessment

For the commercial culture of the three‐spot cichlid (Amphilophus trimaculatus), it is important to have available a set of protein and lipid ingredients suitable for feed manufacturing, which allow to optimize the culture at affordable costs. The in vitro digestibility was evaluated with pH‐stat technique, using stomach and intestine multi‐enzymatic extracts from A. trimaculatus juveniles. The digestion of protein ingredients was taken place both in acid and in alkaline conditions, quantifying the total of free amino acids at the end of the hydrolysis, whereas the digestion of lipid ingredients was taken place only in alkaline conditions. The digestive enzymes of this species showed a better affinity to raw materials of animal origin such as beef meal, fish meal and premium chicken meal, which presented better digestibility. The best lipid ingredient that could be used is the fish oil. However, it is possible to use ingredients from the plant sources, such as soy or cereals, and vegetable oils such as olive, corn or soy oil. It is necessary to complement this study in vitro with the digestibility analysis in vivo, in order to determine the inclusion percentages in feeds and costs and therefore to develop an efficient feed formulation for the aquaculture of A. trimaculatus.     

橘色双冠丽鱼体色相关基因mitf的结构及表达调控特性

为了解小眼畸形相关转录因子mitf基因在鱼类早期体色褪黑过程中的调控作用,本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) mitf基因cDNA序列全长,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测其在橘色双冠丽鱼胚胎不同发育时期、体色褪黑不同时期和各个组织中的表达规律。获得mitf基因2个亚型,其中,mitf1的cDNA全长为1816 bp,包括5′非编码区(UTR) 158 bp、3′UTR 428 bp、开放阅读框(ORF) 1230 bp,共编码409个氨基酸;mitf2的cDNA全长为1638 bp,包括5´UTR 160 bp、3´UTR 428 bp和ORF 1050 bp,共编码349个氨基酸。同源性和系统进化分析显示,mitf1和mitf2聚在一小支,与慈鲷科(Cichlidae)鱼类同源性最高,与哺乳类动物同源性较低。qRT-PCR结果显示,在成鱼各个组织中,mitf1和mitf2均有不同程度表达,其中,眼部表达量最高且显著高于其他组织(P<0.05),肌肉、脑和肾脏也有较高表达;mitf1和mitf2在胚胎各个发育时期均有表达,在受精卵时期表达量最高,显著高于其他胚胎期;随着橘色双冠丽鱼体色由黑色过渡到橘黄色,mitf1和mitf2在鱼皮肤、鳞片、尾鳍中的表达均呈逐渐下降的趋势,表明mitf基因表达与鱼体色由黑到黄转变的表型间存在关联性,推测与鱼体色发育阶段色素细胞的分化和分布比例的动态变化相关。本研究通过了解鱼类体色发育和变异的分子基础,可为鱼类色素细胞发育和体色人工改良积累资料。     

橘色双冠丽鱼黑色素细胞和黄色素细胞的分离、培养与鉴定

为探讨橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)黑色素细胞和黄色素细胞的分离、培养与鉴定方法,观察鱼类色素细胞生长特征,本研究以橘色双冠丽鱼的尾鳍、鳞片、皮肤组织为材料,在25℃~28℃条件下,分别在胰蛋白酶溶液和胶原酶溶液中消化6 h和12 h,可有效分离出色素细胞团,细胞悬液经气孔尼龙网过滤后,于35%-45%-55% Percoll试剂中梯度分离和收集黄色素细胞和黑色素细胞。采用K-SFM培养基进行细胞原代培养和细胞纯化,抑制成纤维细胞和角朊细胞的生长,用十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)、双抗、bFGF的DMEM培养基进行色素细胞传代培养;运用巴染色和透射电镜观察细胞形态,并用分子标记技术进行细胞鉴定。结果显示,细胞分离时,黑色素细胞位于Percoll试剂45%和35%浓度层之间,黄色素细胞位于Percoll试剂35%浓度层上,2种色素细胞均凝聚成絮状。透射电子显微镜观察发现,黑色素细胞内部含大量黑色素小体,而黄色素细胞内部含喋呤体和类胡萝卜素囊泡;黑色素细胞左旋多巴(L-DOPA)染色呈阳性;取第10代色素细胞进行体色相关基因黑皮素1受体(melanocortin receptor 1, MC1R)、酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)和牛内皮素受体B(endothelin receptor B, EDNRB) PCR检测,显示基因扩增条带特异性强,表明获得的2种色素细胞具有良好的生物学活性。本研究建立了橘色双冠丽鱼黄色素细胞和黑色素细胞的分离培养与鉴定方法,为进一步开展鱼类体色细胞分化和体色形成的分子机理研究提供了细胞模型。     

橘色双冠丽鱼胚后色素细胞发育与体色变化

采用生物显微镜和体式显微镜等对橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus Günther 1864)早期发育过程中体色和色素细胞的分布及形态变化进行连续观察。结果显示,在水温为(27±1)℃,pH 8.3条件下,仔鱼期:初孵仔鱼体表已具有黑色素,2 dph(day post hatching,dph)黑色素增加,眼窝变黑,未有视觉功能;3dph卵黄囊尚未吸收完毕,黑色素细胞分支,形态多样;4 dph仔鱼有视觉功能,能自行游动;5 dph仔鱼开口,卵黄囊明显变小;7 dph仔鱼出现虹彩细胞;10 dph仔鱼体表出现黄色素细胞;12 dph各鳍被成鱼鳍膜所取代,黑色素细胞、黄色素细胞继续增多,视觉看到鱼体变黑。稚鱼期:19 dph有鳞片产生,各鳍条发育完全,30 dph发现红色素细胞;幼鱼期:35 dph幼鱼体表为黑色,初步形成7条色素带,全身布满鳞片;65 dph鱼体部分黑色素开始褪去;85 dph黑色素细胞全部褪去,鱼体变为亮黄色。研究结果为培育褪黑完全而且遗传稳定的橘色双冠丽鱼奠定了理论基础。     

MS-222对鹦鹉鱼麻醉效果的研究Anesthetic Effect of MS-222 on Amphilophus 高仁法 刘 毅 陈舒畅 周鑫蔚 曲乐天 夏 腾 徐 晔 许建和*

本文研究了MS-222在不同浓度下对鹦鹉鱼的麻醉效果,观测了其不同麻醉和复苏阶段的表现,探讨了急性麻醉和模拟长途运输中适宜的麻醉浓度。结果表明MS-222对于鹦鹉鱼有很好的麻醉效果,起到了有效的降低应激的作用。急性麻醉中,MS-222的理想麻醉浓度为135 mg/L,长途运输中MS-222的适宜浓度为40 mg/L。     

饲料脂肪水平对血鹦鹉鱼吸收虾青素效果、生长性能和血清生化指标的影响#br#

为了探讨血鹦鹉鱼(Vieja synspila♀×Amphilophus citrinellus♂)增色期饲料脂肪水平对其生长、免疫力和吸收虾青素的效果,选取540尾血鹦鹉鱼随机分为6组,投喂虾青素为4‰而脂肪添加水平分别为2.93%(对照组)、5.90%、8.89%、11.91%、14.94%、17.92%的饲料60 d。结果显示:1)随着脂肪添加量的增加,血鹦鹉鱼增重率和特定生长率先升高后降低,饲料脂肪水平为11.91%时增重率和特定生长率达到最高值,与对照组差异显著(P<0.05)。2)体色的红值(a*)、黄值(b*)和组织中的类胡萝卜素含量均随着脂肪添加量的增加呈先升高后降低的趋势,体表红值(a*)和类胡萝卜素含量均在脂肪添加水平为14.94%时达到最大值,且显著高于其他组(P<0.05);黄值(b*)在11.91%组达到最大值,与14.94%组无显著差异,但显著高于其他组(P<0.05);体色亮度值L值在各组间无显著差异(P>0.05)。3)游离脂肪酸(NEFA)在14.94%组达到最低值,并显著低于其他组(P<0.05);总蛋白(TP)在11.91%组最高,显著高于对照组(P<0.05);胆汁酸(TBA)和血清总胆固醇(TCHO)含量分别在11.91%组和14.94%组达到最大值,且显著高于其他组(P<0.05)。研究表明,在一定虾青素含量的饲料中,适量添加脂肪可提高血鹦鹉鱼的生长性能、有效改善虾青素的吸收效率、增强机体免疫力,过高的脂肪水平则对虾青素吸收无益。综合分析各指标,推荐血鹦鹉鱼着色饲料(4‰虾青素)中适宜的脂肪水平为11.91%~14.94%。