猪瘟病毒NASBA-RT-LAMP快速检测方法的建立

本研究基于核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)和反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种针对猪瘟病毒的,快速、灵敏、特异的两步法检测技术。该方法的检测灵敏度与反转录巢式PCR(RT-NestPCR)相当,最低能检测出46 pg/μL的病毒RNA。该方法的建立为猪瘟病毒的快速诊断提供了新思路。     

罗斯河病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank中收录的罗斯河病毒(RRV)基因序列,以其保守的E2基因为靶序列,设计并筛选出一套特异性LAMP引物;通过优化反应条件,最终建立了RRV RT-LAMP检测方法,并对其灵敏度、特异性进行了验证。结果显示:本方法对RNA样本的最低检测限可达10拷贝/25μL,而荧光RT-PCR方法和常规RT-PCR方法的灵敏度分别为10拷贝/25μL、100拷贝/25μL;其特异性良好,不与同属或相似病毒发生交叉反应。结果表明,本方法灵敏、特异、快速、便捷,可应用于我国虫媒病高发区的RRV筛查预警。     

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1, DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25 μl反应体系中包含2.5 μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart® DNA聚合酶、0.8 μmol/L EvaGreen®和4.4 μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×102拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder®替换EvaGreen®并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。     

布氏杆菌S2疫苗株特有基因trbJ的LAMP检测方法建立

为了建立一种快速、准确地检测布氏杆菌S2疫苗株的环介导等温扩增(LAMP)方法,将S2基因组与牛种、羊种野毒株基因组比较,筛选出S2疫苗特有基因trbJ作为检测靶标序列,设计LAMP特异性引物,在对该反应组分、反应条件进行单因素优化的同时,还对该引物特异性、灵敏度、重复性进行测试。结果显示,该方法在65℃等温条件下扩增,反应结束后加入SYBR Green I荧光染料,即可通过肉眼直接观察结果。该方法灵敏性、特异性、重复性良好,能准确鉴别出S2疫苗,与对照菌株无交叉反应。与普通PCR技术相比,LAMP检测灵敏度高100倍,最低可检测出6.89 pg/μL的DNA模板,并且不同批次试剂间的重复性良好。本试验成功建立了一种快速、准确、可视化地检测S2疫苗的LAMP方法。     

一种基于RPA的番茄褪绿病毒检测方法

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起番茄褪绿病毒病,给番茄生产造成严重危害。开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。利用番茄褪绿病毒外壳蛋白(CP)基因序列,设计特异性引物,建立了ToCV的重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)检测方法,同时分析了该方法的灵敏度和特异性。结果表明,建立的ToCV-RPA方法在38℃恒温下40 min可从ToCV阳性的番茄样品中扩增出246 bp的特异性条带。扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR方法的10倍,适用于ToCV的快速检测。     

北美栅锈菌和松杨栅锈菌可视化检测体系建立

目的 为实现北美栅锈菌和松杨栅锈菌快速有效的鉴别及鉴定。 方法 本研究根据两种锈菌的28SrDNA基因序列设计若干组LAMP引物。经筛选得到的引物以北美栅锈菌、松杨栅锈菌、图拉斯叉钩丝壳菌、芍药白粉菌、梨胶锈菌、羊肚菌、金针菇的基因组DNA为模板进行LAMP反应并完成特异性检测;首先建立初始LAMP反应体系,再进一步优化LAMP反应体系的组分和反应条件,加入羟基萘酚蓝实现可视化检测;最后确定检测体系灵敏度。 结果 表明,筛选出的引物具有特异性;25 μL北美栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg2＋浓度为6 mmol·L−1,最佳内外引物比例为8：1,最佳dNTPs浓度为1.2 mmol·L−1;同样地,25 μL松杨栅锈菌LAMP检测体系最佳Mg2＋浓度为4 mmol·L−1,最佳内外引物比例为6：1,最佳dNTPs浓度为1 mmol·L−1。加入160 μM羟基萘酚蓝（HNB）可清晰地指示反应结果,两种检测体系在61 ℃条件下,分别反应30 min和40 min可实现目视判断结果,且灵敏度分别可达34 fg·μL−1和60 fg·μL−1。 结论 通过建立两种锈菌的可视化LAMP-HNB检测体系可实现对北美栅锈菌和松杨栅锈菌进行区分及鉴定,为快速鉴定和区分重要杨树锈病提供了技术支撑和实践参考。     

基于环介导等温扩增技术检测大豆北方茎溃疡病菌

[目的]传统的以ITS(内转录间隔区)为靶序列对大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora,DPC)的分子检测无法区分大豆南方茎溃疡病菌(D.phaseolorum var.meridionalis)和大豆拟茎点种腐病菌(Phomopsis longicolla)等近似种。笔者在大豆北方茎溃疡病菌靶标序列筛选中,发现了翻译延伸因子(translation elongation factor 1α,tef1α)序列。通过目标病原菌与其相似种比对发现,大豆北方茎溃疡病菌在tef1α序列上有很好的特异性,适合作为分子检测的靶标。[方法]基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以tef1α为靶序列,设计LAMP特异性引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的DPC检测方法,并进行特异性、灵敏度、植株接种试验和进口大豆夹带大豆病残体检测。[结果]该方法仅需60 min,即可通过肉眼直接目测试验结果。64℃等温条件下进行核酸扩增反应60 min,反应结束后,加入SYBR greenⅠ染料,根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,在DPC菌株中扩增到梯形条带,同时加入SYBR greenⅠ染料后可观察到绿色荧光的阳性反应;而在其他供试菌株中均没有出现梯形条带,加入SYBR greenⅠ染料后则保持橙色的阴性反应。该技术最低检测限为1 pg·μL-1目标菌纯DNA。tef1α-LAMP技术能够检测出所有人工接种发病豆苗中的目标菌。在口岸截获的大豆病残体检测中,tef1α-LAMP技术能够在10 g进口大豆中夹带的大豆植株残体中最低检测出10个子囊孢子。[结论]该方法的建立为大豆北方茎溃疡病菌的检疫以及其所致病害的快速诊断提供了新的技术。