青年专家文库——宋长绪

宋长绪,男,1965年生,博士,研究员，广东省农科院兽医研究所猪病研究室主任。广东省农科院第1届和第3届中青年学科带头人。1993年在西北农业大学兽医系获硕士学位．1996年在华南农业大学获得博士学位．1996年分配到广东省农业科学院兽医研究所工作。     

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选

在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5～ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库 ,可消除假阳性     

我国首次完成海藻基因组大规模测序

由中国科学院北京基因组研究所胡松年研究员和中国科学院海洋研究所王广策研究员共同主持的“坛紫菜大规模测序和生物信息学分析”研究项目日前取得重大进展。     

表达序列标签（ESTs）及其应用

表达序列标签(ESTs)是指从(ESTcDNA文库中随机挑取克隆并对其3’或5’端进行单轮自动测序所获得的短cDNA库列，一般长度为300～500bp。要有效获取ESTs，必须对cDNA文库进行预处理，处理方法有衰减杂交法、均一化法和差异显示法。在dbEST中收录了大量各种生物的ESTs。ESTs广泛应用于鉴定基因、发现新基因、电子克隆、构建遗传学图谱、制备DNA芯片、分子标记、研究基因的差异表达及检验病原微生物等方面。     

鸡13号染色体比较图谱的改进（完善）

鸡13号染色体(GGA13)与人类5号染色体(HSA5)的一部分构成比较图谱。用GGA13特异性微卫星标记扫瞄Wageningen鸡细菌人工染色体(BAC)文库。所选BAC克隆最终被测序，57个STS位标被用来构建克隆重叠群。在GGAl3上衷情共检测到了204个BAC克隆，这些克隆约20％是重叠的。基因检测采用双向式方法院。首先从已经不定位的鸡BAC亚克隆序列开始，通过BLAST数据库工具，检测人类和小鼠折同源基因。第2步在人在HSA5q23-q35区域寻找与鸡同源的人类基因。接着用荧光原位杂交(FISH)或SNP方法将鸡的同源基因定位。本研究的比较图谱改进之处在于，使GGAl3上定位的基因数从14增加到20；GGAl3染色体定位的基因有人类HSA5q23-q35，小鼠Mull、Mull3、Mul8染色体上的同源基因。     

SMART技术构建的辣椒疫霉菌与辣椒互作AD-cDNA文库

为了分离和克隆辣椒中疫霉菌诱导基因,以接种辣椒疫霉菌的叶片为材料,利用SMART技术构建辣椒疫霉菌与辣椒互作的双杂交c DNA文库。结果表明:该文库容量为3.6×106cfu,重组率88%左右,插入片段集中在300~2000bp之间,平均长度约为800bp,表明获得的文库质量较高,该文库将为分子育种提供重要的基因资源。     

不同施肥方式对红壤蔬菜田氨氧化细菌和氨氧化古菌群落的影响

通过构建氨单加氧酶基因(amoA)克隆文库,研究在红壤蔬菜田上只施用磷钾化肥(PK)、只施氮磷钾化肥(NPK)、施用腐熟有机肥(DNPK)和施用新鲜有机肥(FNPK)等4种不同施肥处理的土壤氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)群落多样性及与土壤脲酶活性的相关性。结果表明:施加有机肥处理(DNPK和FNPK)的蔬菜田土壤的AOB文库和AOA文库OTU数量和Shannon指数高于只施用无机肥(NPK和PK)处理的蔬菜田土壤;DNPK和FNPK处理的土壤优势AOB菌群为多形亚硝化叶菌(Nitrosolobus multiformis),比例分别为88.5%和68.5%,NPK和PK处理的土壤优势AOB菌群为亚硝化单胞菌属(Nitrosospirasp.),比例分别为54.8%和65.5%;DNPK、FNPK、NPK和PK处理土壤优势AOA菌群均为阿伯丁土壤亚硝化细杆菌侯选种(CandidatusNitrosotalea devanaterra),比例分别为90.9%、84.4%、77.8%和45.2%;施加有机肥处理(DNPK和FNPK)的土壤脲酶活性和氨氧化微生物的多样性指数都高于只施用无机肥处理(NPK和PK);AOA群落多样性指数与土壤脲酶活性呈显著正相关,而AOB群落多样性与土壤脲酶活性相关性不显著。总体来看,有机肥比无机肥处理提高了AOA和AOB群落多样性,且AOA在红壤蔬菜田土壤氨氧化过程中起着更为重要的作用。     

枣抑制消减cDNA文库构建与分析

枣树具有独特的开花结果特性,为获得枣花发育基因,以金丝4号枣不同发育时期的花蕾和同时期的叶片cDNA互为试验方和驱动方,利用抑制消减杂交技术分别构建了枣花和枣叶抑制消减杂交cDNA文库(SSH文库)。枣花和枣叶SSH文库重组率分别是92.05%和90.26%,插入片段长度均介于200~2 000 bp之间,主要集中于1 000 bp左右。分别从枣花和枣叶SSH文库中随机挑选1 000个阳性克隆进行DNA测序、组装拼接,结果显示枣花SSH文库中获得96条unigene,其中contigs 43个,singletons 53个,96条unigene预测得到73个ORF,经过同源比对分析获得有注释的序列20条,按功能分为7类;枣叶SSH文库中获得86条unigene,其中contigs 45个,singletons 41个,86条unigene预测得到70个ORF,经过同源比对分析获得有23条注释的序列,按功能分为6类。     

人兽共患寄生虫病候选疫苗分子筛选方法研究进展

人兽共患寄生虫种类多、宿主广泛且危害严重。血吸虫病、棘球蚴病、囊尾蚴病、旋毛虫病、弓形虫病等是常见的重要人兽共患寄生虫病。人类和家畜饱受寄生虫病的危害,这对公共卫生和畜牧业造成了很大的影响。控制传染源、切断传播途径和保护易感群是控制人兽共患寄生虫病流行的综合防控措施。在综合防控策略中,疫苗的使用是切断循环链、控制乃至消灭人兽共患寄生虫病的理想和有效途径之一。选用高效的抗原筛选方法挖掘潜在的疫苗候选分子是开发疫苗的前提和关键。抗原筛选技术的更新换代使得研究者发掘出了更多新抗原和保护性多肽。现有的抗原筛选方法主要包括传统的粗抗原筛选法、cDNA文库筛选法、蛋白质组学筛选法、生物信息学及多组学技术联合筛选法。很多抗原筛选的方法是伴随寄生虫疫苗研究的发展应运而生的,粗抗原筛选法是基于抗原抗体相互反应的免疫学原理而设计的,此方法筛选的天然抗原可引起机体较强的免疫反应;cDNA文库筛选抗原的优势在于筛选更有针对性,所以候选产物的成分更单一、明确;蛋白质组学筛选法是基于质谱而兴起的一种筛选技术,它既可对未知蛋白组分进行鉴定,还可对鉴定结果进行差异比较,在未知分子的发现和功能特殊的靶分子筛选中发挥着重要作用;随着后基因时代的到来,生物信息学及多组学联合筛选技术使得抗原筛选逐步进入了多维、立体的筛选模式,也使得候选抗原及其表位的功能研究更加深入,这为基因工程疫苗和多肽疫苗候选分子的筛选提供了技术手段。     

霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库构建

[目的]构建霜霉菌侵染后葡萄叶片的酵母双杂交cDNA文库,筛选致病因子在寄主葡萄体内的互作靶标,为葡萄霜霉病菌致病的分子机理研究提供材料基础.[方法]以一年生欧亚种葡萄西拉盆栽苗为试验材料,提取并等量混合霜霉菌侵染后0、12、18、24和36 h的葡萄叶片总RNA,利用基于Gateway技术的CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒:首先将cDNA与pDONR222载体进行BP重组反应连接,连接产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建初级文库;然后初级文库质粒与pGADT7-DEST载体通过LR重组反应,重组反应产物转化大肠杆菌DH10B感受态细胞构建次级文库;再随机挑取次级文库转化Y187酵母菌株构建酵母双杂交cDNA文库;最后利用ImageJ软件和PCR反应分别统计库容量和鉴定重组率.[结果]构建的初级文库库容量为4.6×107 CFU,次级文库库容量为2.7×107 CFU,均达到构建cDNA文库的标准.酵母双杂交cDNA文库的插入片段主要集中在1000~2000 bp,且具有很好的多态性,文库质量较高.[结论]构建的霜霉菌诱导葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库符合酵母双杂交筛选要求,可用于筛选霜霉菌致病效应蛋白在寄主体内的靶标及霜霉菌侵染寄主葡萄早期抑制寄主免疫过程中的致病机理研究.