基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”,Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”,建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol•L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为“捕获抗体”,多抗为“检测抗体”,建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43 μg•mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng•mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。     

草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒的研制

通过对包被单抗和酶标单抗以及抗原最佳工作浓度的优化,建立草鱼肠型点状产气单胞菌双抗夹心ELISA试剂盒检测体系。用分光光度法对检测体系的特异性、稳定性和灵敏度进行测定;用脱脂奶平板法对试剂盒的临床应用进行检测。结果表明,单抗最适稀释液为pH9.4的碳酸盐缓冲液,洗涤液为含φ=0.05%Tween-20的PBS,包被单抗最适体积稀释倍数为1∶800,酶标单抗最适体积稀释倍数为1∶6 000,抗原最佳工作浓度为3×104cfu/mL。试剂盒与肠型点状产气单胞菌有特异性反应,脱脂奶平板法与试剂盒法对草鱼患病检出率基本一致,符合率达90%;试剂盒有很好的储存稳定性,检测灵敏度为7×103cfu/mL。     

应用双抗夹心ELISA法检测皱纹盘鲍致病病原—创伤弧菌的研究

以皱纹盘鲍脓足病致病病原－ － 创伤弧菌为抗原,制备兔抗血清,抗体纯化后以辣根过氧化物酶标记,建立检测创伤弧菌的双抗夹心ＥＬＩＳＡ 检测法。结果表明,双抗夹心ＥＬＩＳＡ 法有较高的灵敏度,可检出含菌１０４ 个／ｍｌ 的菌悬液。与创伤弧菌对照菌株有明显的阳性反应不与副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、河流弧菌等８ 株对照菌株产生影响检测结果的交叉反应。应用该法检测３０ 份病鲍样品,阳性检出率为６６ ．７ ％ 。     

鸡白细胞介素-6原核表达及双抗夹心ELISA方法的建立

应用分子生物学技术原核表达ChIL-6，以ChIL-6重组蛋白为免疫原，按免疫程序分别制备兔抗和鼠抗IL-6重组蛋白的多克隆抗体。应用此抗体建立双抗夹心EL-ISA方法后，为了优化此方法本试验对该方法的最佳试验条件、标准曲线、重复性和初步应用进行确定。结果显示，经SDS-PAGE和Western-blot分析，表明ChIL-6在大肠杆菌中正确表达，为了建立检测ChIL6的双抗夹心ELISA方法，本试验应用表达的重组蛋白制备兔抗和鼠抗多克隆抗体。建立的双抗夹心ELISA方法最佳反应条件为包被抗体的质量浓度为50mg／L，4℃过夜；酶标二抗稀释度为1：400，37。C1h；应用该方法检测感染金黄色葡萄球菌后的ChIL-6，其结果与本实验室之前应用人的ELISA试剂盒检测的结果相似。结果表明，本试验建立的检测ChlL-6的双抗夹心ELISA方法可用于临床。     

基于量子点的赭曲霉毒素AsFLISA检测技术研究

建立了基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)双抗夹心荧光免疫检测(sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay,sFLISA)体系,包含多克隆包被抗体、生物素标记的多克隆检测抗体、量子点标记的链霉亲和素等,获得了sFLISA的最佳操作参数:包被抗体浓度2.5μg/mL,检测抗体稀释500倍,量子点标记链霉亲和素稀释100倍。该方法在OTA浓度3.125~125μg/L之间时,相对荧光强度和OTA浓度呈线性关系,回归方程为y=0.0206x+0.2018,R2=0.9924;加标回收率在90.1%~110.0%之间,变异系数均小于10%,能较好地进行赭曲霉毒素A的定量检测。     

黑籽南瓜种间杂交研究

通过调整播期克服了南瓜属种间花期不遇的问题,以美洲南瓜、中国南瓜、印度南瓜3个种共12个材料与黑籽南瓜进行了种间杂交试验。黑籽南瓜为母本不结实,以其他3个种为母本则均可结实。美洲南瓜×黑籽南瓜及印度南瓜×黑籽南瓜杂交获得的果实内均无种子。获得了18株中国南瓜×黑籽南瓜F1植株。种间杂种F1植株雄蕊退化,以其作为母本以中国南瓜或黑籽南瓜为父本进行回交,可结实但无种子。中国南瓜×黑籽南瓜F1形态为双亲中间型偏父本,其抗病性、抗虫性不及父本黑籽南瓜而倾向于母本中国南瓜。     

猪轮状病毒性腹泻的ELISA双抗夹心法检测及防治建议

[目的]为猪轮状病毒的针对性防治提供建议。[方法]以不同来源、不同饲养方式下218头猪的粪便为材料,用ELISA双抗夹心法检测其中的轮状病毒（RV）抗原,结合流行病学调查对猪轮状病毒的发病因素及发病特点进行分析。[结果]RV多为隐性感染,且感染率较高。从所取218份样品中共检测出RV阳性50头份,阳性率为22．94％,其中,仔猪170头份,阳性率22．35％,中猪48头份,阳性率25．0％;笼养模式下猪的发病率最低,为17．43％,农户圈养方式下猪的发病率最高,达36．84％。[结论]流行病学调查结果显示,仔猪对RV的感染率高于中猪,采取笼养模式,并对仔猪进行RV防治可降低猪RV的发病率。     

黑龙江省大豆新品系双抗大豆灰斑病、疫霉病鉴定

2005年大豆灰斑病采用田间人工喷雾接种方法、大豆疫霉根腐病采用下胚轴伤口接种方法,对黑龙江省大豆新品系进行大豆灰斑病、疫霉根腐病抗性鉴定筛选研究,从中鉴定出5份抗大豆灰斑病、疫霉病的双抗资源,它们是:合00-23,建99-130,哈交98-5129,哈交20-5489,东农276,及一大批单抗灰斑病、疫霉根腐病的种质.并建立了比较全面的抗性调查评价体系.     

新疆规模化牧场奶牛病毒性腹泻病毒持续感染状况的流行病学调查

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（BVDV）引起的牛的一种急性、热性、接触性传染病,可造成牛只的免疫抑制和持续感染,导致牛只繁殖率下降、流产、死胎以及犊牛多种疾病高发和高死亡率,严重影响养殖经济效益和可持续发展。以新疆不同养殖模式、不同年龄奶牛、不同区域（南疆和北疆）为研究对象,采集血清和耳组织,应用双抗夹心ELISA抗原法等方法,对7 个牧场的11 592 头奶牛BVDV的持续感染（PI）牛进行了检测。结果表明,各牧场均存在BVDV的PI阳性牛,场阳性率100.00%;群体阳性率为0.79%（91/11 592）。其中,南疆牧场的感染率高于北疆牧场,成母牛感染率高于犊牛,传统型牧场感染率高于现代化牧场。提示需要高度重视,全面开展PI牛的检测和淘汰阳性牛是控制该病的关键。     

进境番茄种子中番茄花叶病毒的检测与鉴定

利用双抗夹心 酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA)和反转录 聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对来自韩国的番茄种子进行种传病毒检测。结果表明,在该批番茄种子中检测到番茄花叶病毒（ToMV）和烟草花叶病毒（TMV）。PCR产物测序结果表明,ToMV特异引物（ToA/ToB）与TMV特异引物（TA/TB）扩增的片段均为ToMV的外壳蛋白（CP）基因及3′非编码区（3′ UTR）,该片段与其他ToMV分离物的核苷酸序列相似性为98.2%~99.9%。本研究利用重新设计合成TMV和ToMV特异引物对该批种子进行RT PCR检测,仅ToMV特异性引物（ToMf1/ToMr1）扩增到670 bp的预期片段,TMV特异引物（TMf1/TMr1）则未出现特异性扩增,表明重新设计的引物可准确区分ToMV和TMV。以上结果证实该批番茄种子仅携带ToMV。