橘色双冠丽鱼TYR基因的克隆及其发育时序和组织表达分析

酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是动物体内黑色素合成信号通路中起关键性作用的限速酶,黑色素生成的速度和种类取决于TYR基因的表达量和活性水平.为了解色素相关基因与体色变化的关系,采用cDNA末端快速克隆技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术获得橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus) TYR基因cDNA全序列,并利用qRT-PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中TYR基因的表达差异.实验获得cDNA全长序列2 683 bp,其中阅读框1 620bp,编码540个氨基酸,5'UTR区246 bp,3'UTR区817 bp.氨基酸序列和系统发育分析表明,相比与脊椎动物间的保守性,TYR蛋白序列在鱼类间的保守性更高.qRT-PCR结果表明,TYR基因在胚胎各期均有表达,受精期表达量最低,血液循环期开始急速上升;在“黑色-灰色-亮黄色”三个典型体色褪黑过程中,各组织TYR基因表达量均在黑色期呈现最高值,显著高于灰色和亮黄色期,灰色到亮黄色时期鳞片和尾鳍的TYR基因表达量逐渐降低,但差异不显著(P＞0.05),而皮肤组织的TYR基因表达量在三个体色褪黑期均显著降低(P＜0.05);亮黄色时期,TYR基因在心、肾、脑、鳔、性腺、尾鳍和眼等组织均有表达,其中眼部表达量最高,其次是鳔和尾鳍,皮肤和性腺表达量最低.橘色双冠丽鱼TYR基因在三个典型体色褪黑期表达逐渐降低,可能与红色素细胞和黄色素细胞逐渐增多以及黑色素细胞数量和分布比例发生变化相关.本研究通过了解体色变异的分子基础,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料.     

杂交三倍体泥鳅性腺发育观察及其基因表达分析

以杂交三倍体泥鳅(4n♀×2n♂)为研究对象,对其早期性腺分化的组织学进行观察,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对杂交三倍体泥鳅早期不同发育时期(孵化后4、14、21、23、50、60和65d)和不同组织(性腺、肝脏、肌肉、肠、鳃、鳍、皮肤和脑)中性腺发育相关基因(hormad1、dmrt1-a)的表达量进行定量检测。研究结果发现:在早期不同发育时期,hormad1和dmrt1-a基因均为在4日龄中表达量最高,14日龄次之,在50日龄中表达量最低。在不同组织中,hormad1基因在雌鱼的鳍中表达量最高,肝脏中表达量最低;在雄鱼的性脑腺中表达量最高,肝脏中表达量最低。dmrt1-a基因在雌雄鱼的性腺中表达量最高,脑中表达量最低。杂交三倍体泥鳅早期性腺的分化和发生与二倍体泥鳅无差别,可观察到原始生殖细胞、原始生殖细胞的迁移和原始性腺的生成及性腺的分化等过程。研究结果表明,hormad1、dmrt1-a这2个基因与杂交三倍体泥鳅早期性腺发育密切相关。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

甜樱桃花芽不同发育时期内参基因的筛选与验证

为了筛选甜樱桃花芽不同发育时期均稳定表达的内参基因,以甜樱桃桑提娜和黔樱一号不同发育时期花芽为材料,通过qRT-PCR技术检测28S rRNA、EF1-a1、EF1-a2、UBC、RPL13、18S rRNA、RSP3、CYP40、ACT2和α-TUB3等10个常用看家基因的表达水平,并利用GeNorm、NormFinder和BestKeeper综合评价其表达稳定性。结果表明,EF-1a2和RSP3在所有样品中稳定性最好。分别以EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3作为内参基因检测不同发育时期花芽生长素运输载体AUX1基因及生长素响应因子ARF基因的表达模式,该2个基因在不同内参基因标定下表达模式相同。表明EF-1a2、RSP3及EF-1a2+RSP3可作为甜樱桃花芽不同发育时期的内参基因。     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

低频声波频率下瘤背石磺CaM-like、CaMKII基因的表达及功能

长期栖息于潮间带的动物能够感知当地的潮汐规律,形成潮汐记忆的能力。本研究以栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)为对象,研究其通过感知潮汐来临时产生的低频声音来调节其行为与潮汐节律相协调的分子机制。通过RACE-PCR技术克隆到CaM-like基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaM-like基因的cDNA全长2321 bp,包括5′非编码区(UTR)366 bp,3′非编码区(UTR)1337 bp,618 bp的开放阅读框编码206个氨基酸;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3165,分子量约为23029.64 kD,理论等电点4.64,分子式是C_(1018)H_(1544)N_(274)O_(320)S_9。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺CaM-like基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CaM-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学分类相吻合。在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,应用qRT-PCR检测CaM-like基因在不同组织的分布情况,结果显示CaM-like mRNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于背部皮肤、腹足、肠、肝胰腺、口器和蛋白腺等组织(P0.05),推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示CaM-like、CaMKII基因分别在25 Hz和50 Hz低频声波下刺激12.4 h表达量较高,初步推测其能感知25～50 Hz声波频率。这可能与栖息于潮间带中的瘤背石磺长期感知12.4 h半日潮潮汐周期节律,形成潮汐记忆有关。本研究将为进一步深入了解瘤背石磺感知潮汐节律的分子机制奠定基础,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供依据。     

池蝶蚌组织蛋白酶L1-like基因的克隆及表达特征分析

为了解淡水贝类是否存在组织蛋白酶L的亚型及其亚型的免疫相关作用,本实验利用已构建的池蝶蚌血细胞全长c DNA文库,筛选获得与之同源的EST序列,结合RACE技术进一步克隆了池蝶蚌一个新的组织蛋白酶L基因的c DNA全长,命名为Hs Cts L1-like基因(Gen Bank登录号为KF015273)。该序列全长为1280 bp,5′-非翻译区(5′UTR)为31 bp,3′-非翻译区(3′UTR)为256 bp,开放阅读框区(ORF)为993 bp,编码330个氨基酸,预测蛋白相对分子量为36.86 ku,理论等电点为6.23。序列分析结果显示,Hs Cts L1-like与其他软体动物相对应序列具有共同结构特征,包含信号肽、前肽抑制域和成熟肽三部分,在其他物种中已鉴定的Cts L签名序列标签(ERF/WNIN、GNFD、GCXGG和QCHN等)在Hs Cts L1-like中均可找到。其氨基酸序列同缢蛏Cts L1(AGL33704.1)同源性最高,达67%;与报道的三角帆蚌Cts L(ADV03094)和池蝶蚌中另一个Cts L(AEX88474)仅均为52.91%;系统进化分析表明,Hs Cts L1-like与缢蛏、长牡蛎和合浦珠母贝的Cts L1聚为一分支,推测Hs Cts L1-like属于Cts L家族中的亚型1。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测显示,Hs Cts L1-like m RNA在肝脏中表达量最高,其次是卵巢和精巢。注射鳗弧菌后,血细胞和肝脏Hs Cts L1-like m RNA转录水平显著升高,暗示其是一个免疫有关的基因,参与了池蝶蚌的先天免疫应答反应。     

小麦DEAD-box基因家族鉴定及其低温下的表达模式分析

DEAD-box RNA解旋酶是RNA代谢途径中的关键酶,在RNA代谢过程中调控植株的生长发育和抗逆性。目前,尚未见有人对小麦DEAD-box基因家族进行系统鉴定与分析。为探究小麦DEAD-box基因的功能,本研究以水稻DEAD-box基因家族基因为参照,从小麦全基因组数据库中共鉴定到134个小麦DEAD-box家族基因,并利用生物信息学对其家族成员的理化性质、基因结构、进化树和共线性进行分析。结果表明,小麦DEAD-box蛋白多数为弱碱性蛋白,亚细胞定位分布广泛,核分布最多;小麦与水稻DEAD-box家族基因亲缘性较高,小麦DEAD-box蛋白结构域与核心基序排列有序稳定,高度保守;小麦DEAD-box家族基因在进化过程中可能发生了节段性复制事件,水稻与小麦DEAD-box基因无序共线性连线,说明DEAD-box基因在进化过程中可能存在染色体异位突变。进一步以强抗寒冬小麦品种东农冬麦1号(Dn1)和东农冬麦2号(Dn2)为材料,对其转录组库中低温差异表达的7个DEAD-box基因进行qRT-PCR分析,结果表明,这7个基因在不同品种和不同组织中表达量均有差异。Dn1中DEAD-box基因的表达量在 -10 ℃达到峰值,而Dn2中DEAD-box基因的表达量在-25 ℃达到峰值。