潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。     

鸡马立克病疫苗株CVI988/Rispens meq基因编辑及缺失毒株的构建与鉴定

meq是鸡马立克病病毒（MDV）最重要的致瘤基因，在马立克病（MD）肿瘤发生中发挥关键作用。同时，它在疫苗株和强毒株之间具有明显的序列差异性。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以MDV疫苗株CVI988/Rispens meq基因为靶点，设计合成gRNA，克隆构建pX459-gRNA质粒，转染CEF并感染CVI988/Rispens，然后对meq基因编辑的病毒噬斑进行克隆纯化，经过PCR扩增、测序分析及IFA鉴定，成功构建1株meq基因编辑的缺失毒株CVI988Δmeq-C7，为后续筛选和鉴定抗MD疫苗株MEQ单抗及鉴别诊断研究奠定了基础。     

马立克氏病病毒不同致病型meq基因的比较研究

为了研究马立克氏病病毒（MDV）的meq基因与不同毒株致病性的关系，应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因，测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括：国际通用Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒814株、强毒GA株（vMDV)、特超强毒648A株（vv MDV)以及6个广西分离到的野毒株。结果发现，MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守，它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均在95.6%-99.7%。但是，与所有测试的致病性MDV毒株相比，二个Ⅰ型疫苗毒CV1988/Rispens株和814株均在阅读框的核苷酸序列中缺失第575-577位3个碱基（CAC），导致一个氨基酸（脯氨酸）的缺失。该缺失性突变恰恰位于meq基因的多脯氨酸功能的一个重复序列（EELCAQLCSTPPPPI）之中。该缺失性突变与一个疫苗毒株失去致肿瘤性是否有关，还有待进一步研究。     

Isolation and Identification of a Field Strain of Marek's Disease Virus and Analysis of Major Pathogenic Genes

In a certain area of Shandong province, Marek's disease (MD) occurred in diseased chickens that had been vaccinated by turkey herpesvirus.In order to isolate the virus strain and detect the virus pathogenicity, agar diffusion test, cell culture and indirect immunofluorescence assay (IFA) were used to isolate the Marek's virus from chicken's blood and feather marrow.The isolated strain was adapted to grow in chick embryo fibroblasts (CEF).Genes involved in pathogenesis of MDV, such as meq, pp38 and 132 bp repeat sequence were amplified by PCR.The obtained sequences were compared with that of standard strains published in GenBank by DNAStar software.The results showed that pp38 gene of the SDAU-1 shared homology from 100% with standard virulent sequence.Analysis of 132 bp repeat sequence and meq gene sequences of the viral genome showed that the isolated virus belongs to the highly virulent MDV strains.     

河南鸡群马立克氏病病毒流行毒株的分子进化分析

为了解鸡马立克氏病病毒流行毒株的分子特征,对2012-2014年河南省发病鸡群的临床病料进行了采集,并对MDV 132 bp重复序列进行了PCR扩增,同时对meq、g E、g I基因进行了克隆和序列测定。结果表明,9份病料中均可扩增出与132 bp双拷贝大小相符的PCR主产物;meq、g E、g I基因的核苷酸序列同源性与国内外参考毒株相比,分别为98.5%~100%,98.8%~100%和98.0%~100%;基于这些基因构建的系统发生树的分析结果表明,与美国、澳大利亚、日本以及印度的MDV分离株相比,目前,河南省鸡群中流行的MDV与此前分离的河南流行株进化关系较近,并且与其他国内分离株共同形成一个较大的独立进化分支。     

黄羽肉鸡马立克氏病病毒强毒株GX18NNM4的分离鉴定及其致瘤基因meq的序列分析

为探究黄羽肉鸡鸡群临床异常的发病原因,通过病理剖检、组织病理学观察、PCR检测、细胞培养、间接免疫荧光试验(Immunofluorescent assay,IFA)、序列测定进行病原分离鉴定。结果显示:病鸡心脏、肝脏等器官均有肿瘤样病变;常见肿瘤病病毒PCR检测呈现马立克氏病病毒(Marek′s disease virus,MDV)阳性,细胞培养病毒分离及IFA鉴定结果表明成功分离一株MDV野毒株(命名为GX18NNM4);分离株meq基因的序列分析表明,GX18NNM4与vvMDV参考株GX0101的同源性最高,其核苷酸及氨基酸相似性分别高达99.8%和99.4%,且其突变位点符合国内强毒株的特征。通过氨基酸序列分析发现GX18NNM4的两个脯氨酸重复序列PPPP发生了突变,即PPPP→PNPP,且GX18NNM4与vvMDV/vv+MDV参考株RB1B、Md5、GX0101及648A的脯氨酸发生中断的数量同在0~3的范围内。结果表明该鸡群为MDV感染。     

潜伏期马立克氏病病鸡血清I型病毒L—meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒（MDV）鸡淋巴组织中提取基因组DNA，采用梯度PCR的方法获得MDV的L—meq、meq基因，将其插入pMD18-T克隆载体，经测序并进行了序列分析。结果表明，L—meq、meq基因同源性很高，L—meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L—meq基因消失的原因，试验对L—meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明，L—meq基因中含有9个PRR（proline—rich—reapts）区域，meq中含有6个PRR区域，从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关。该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因，同时也意味着L—meq基因对于潜伏期的维持是必要的。     

Grass species and cultivar differences in magnesium concentration

Abstract

Two rates of Mg, 0 and 56 kg/ha, were randomized within each of 43 cultivars that had previously been established in a randomized complete block design. The 43 cultivars consisted of 6 species. Forage samples were obtained in early spring and chemically analyzed for content of Ca, Mg and K.

Grass species and cultivars with species significantly differed in content of Ca, Mg and K and in the ratio meq K/(meq Ca + meq Mg). Significant interactions of Mg with species and Mg with cultivars within species were observed. At the relatively low level of soil Mg and Mg rate, no cultivar contained 0.20% Mg, a value often used to identify proneness to grass tetany. However, no cultivar had an average meq ratio, K/(Ca + Mg), greater than 2.2, a value often used in diagnosing potential tetany problems that might be associated with intake of low Mg forage.

The interaction of cultivar with Mg rate indicates that fertilizer Mg level influenced cultivar content of Mg, and that the effect was not consistent for all cultivars.     

马立克氏病病毒MEQ蛋白对MDV增殖影响的研究

在马立克氏病病毒MDV致病机理的研究中，弄清致病基因meq与病毒增殖之间的关系及其分子机制是十分重要的基础，以重组反转录病毒（RCAS-meq)感染鸡胚成纤维细胞（CEF），使源于MDV强毒参考株（vMDV)GA株的meq基因表达于宿主细胞内，然后再用GA株感染这些细胞。通过利用MDV强毒株特异的抗pp38单克隆抗体所进行的“黑斑”试验以确定MDV的增殖水平，并与未接种RCAS-meq的CEF进行比较。研究结果发现，细胞内表达的meq基国产物可促进GA株于体外培养细胞中的感染与增殖（病毒斑数增多）。根据试验的结果，作者认为meq基因在感染细胞内的表达水平是MDV增殖以及进而能致病、致瘤的分子基础。     

利用SYBR Green real-time PCR方法监控鸡外周血淋巴细胞中马立克病毒的载量

建立基于SYBR Green Ⅰ的real-time FQ-PCR方法检测并定量鸡外周血淋巴细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)中马立克病毒(Marek's disease virus,MDV)的载量(以meq基因为定量标准),并将此技术的敏感性与标准PCR方法进行对比.应用PCR技术从MDV-1攻毒后的霞烟鸡PBLs中扩增MDV meq基因的部分片段,纯化上述基因的DNA扩增产物,然后克隆到pGM-T载体,重组质粒通过PCR和EcoR Ⅰ酶切及测序分析进行确认；将浓度梯度的meq基因的重组标准品质粒DNA进行real-time FQ-PCR,建立其相应的标准曲线.同样以质粒DNA为模板,real-time FQ-PCR方法的最低检出率为10拷贝,而标准PCR的最低检出率则为32拷贝.结果表明,在检测MDV时,real-time FQ-PCR敏感度比标准PCR要高.