PRRSV GP5基因的原核表达及其免疫性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白GP5含有中和表位,是检测用抗原和亚单位疫苗的首选蛋白。本研究将糖蛋白GP5基因截短后,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠埃希菌,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳显示重组蛋白以包涵体形式得到了表达,每升重组菌可纯化得到目的蛋白87.5mg。Western blot和间接酶联免疫吸附试验分析表明,该蛋白与PRRSV阳性血清具有良好免疫反应性。     

聚合草多肽的酶法制备及其免疫活性研究

为了提高聚合草利用价值,开发聚合草免疫活性肽,利用Box-Behnken设计原理,以多肽含量为响应值,用响应面法构建数学模型,确定制备聚合草多肽的最优工艺条件,并建立Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的体系(MTT法)和LPS促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的体系(中性红法),探究所制备的聚合草多肽的免疫活性。结果表明,将聚合草以8%的料水比打浆,添加3%纤维素酶,调节pH值至6.0,45℃酶解2 h后,再添加4.57%的碱性蛋白酶,调节pH值至8.91,43.4℃酶解56 min,酶解液中的多肽含量达0.664 mg·m L~(-1)。用乙醇沉淀法收集酶解液中的多肽,制成多肽液,结果发现,66、0.66和0.066μg·m L~(-1)的聚合草多肽对小鼠脾淋巴细胞的增殖均具有显著促进作用;66、6.6和0.66μg·m L~(-1)的聚合草多肽对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能均具有显著增强作用。由此可见,本研究所制备的聚合草多肽具有免疫增强活性,这为聚合草的高值利用提供了理论依据。     

羊胎盘提取剩余物发酵制备活性肽工艺及产物生物活性

为实现羊胎盘提取剩余物的高值化利用,该文以超速冻冻藏羊胎盘提取剩余物为原料,利用枯草芽孢杆菌对其进行生物降解制备生物活性肽。通过对发酵过程监控研究了发酵过程中蛋白酶活、产物的平均肽链长度、产物的抗氧化和免疫活性的变化,实现了可控制发酵羊胎盘提取剩余物制备免疫活性肽。研究结果表明:随着发酵时间的延长,蛋白酶活、水解度逐渐升高;平均肽链长度逐渐变小;产物的抗氧化活性和免疫活性均呈现先升高后降低的趋势。在发酵时间35 h下产物具有较好的抗氧化活性和免疫活性,产物的免疫活性与抗氧化活性均随浓度的增大而升高,发酵产物对淋巴细胞的刺激指数最高可达23.37%,发酵产物对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH:1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl)自由基清除率为0.667 mg/m L。超滤结果表明:不同分子量组分的发酵液生物活性有较大差异,其中3~10 k Da组分的免疫活性最高,≤3 k Da组分的抗氧化活性最高。各组分之间的生物活性与原样品相比不具有加和性但是具有明显的协同作用。研究结果为实现可控制发酵制备羊胎盘生物活性肽提供了参考。     

克氏原螯虾原肌球蛋白的纯化及过敏原性分析

以13份甲壳类动物过敏患者血清的Western—blotting分析,确定克氏原螯虾主要过敏原为36ku蛋白质．通过盐析、等电点沉淀及热处理等方法纯化该蛋白质,以兔抗拟穴青蟹原肌球蛋白（Tropo-myosin,TM）多克隆抗体的Western—blotting分析,确定该蛋白质为TM．同源性分析表明,克氏原螯虾TM与南美白对虾TM、拟穴青蟹的氨基酸序列相似性较高（〉90％）．酶切位点预测显示,它分别有49个胰蛋白酶和6个胰凝乳蛋白酶的酶切位点．模拟胃肠液消化实验结果显示,纯化TM不易被胃蛋白酶降解,易于被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解,进一步的Western—blotting和抑制性ELISA分析结果显示,其消化产物仍具有一定的免疫活性．采用蒸煮处理可降低TM的消化稳定性及免疫活性,且蒸煮处理时间越长,效果越显著．说明。TM为克氏原螯虾主要过敏原．与其他甲壳娄动物TM的序列相似件较高．     

Cellulase degradation of shrimp chitosan for the preparation of a water-soluble hydrolysate with immunoactivity

ABSTRACT:   Samples of colloidal chitin and chitosans with deacetylation degrees (DD) of 50, 65, 75 and 95% (DD50, DD65, DD75 and DD95, respectively) were prepared from shrimp chitin. The hydrolytic activity of cellulase on these samples increased with the increasing DD of chitosan, with DD95 being the most easily hydrolyzed. Colloidal chitin was hardly hydrolyzed. The optimal reaction temperature and pH for cellulase digestion of chitosan were 55°C and pH 5.2, respectively. During cellulase digestion of chitosan, the 9-h hydrolysate had the highest enhancing effect on the proliferation of a human hybridoma cell, HB4C5. This hydrolysate is composed of low-molecular-weight chitosan (LMWC), with a molecular mass of 20.0 kDa, and chitooligosaccharides, which are composed of sugars with a degree of polymerization of 1–6. In vitro , the 9-h hydrolysate increased both cell proliferation and immunoglobulin (Ig)M secretion of HB4C5 because of the presence of chitooligosaccharides for the former activity and LMWC for the latter activity. In vivo , samples of the chitosan hydrolysate, chitooligosaccharide mixture and LMWC significantly increased the levels of serum IgG and IgM, and enhanced concanavalin A- and lipopolysaccharide-induced proliferation of mouse lymphocytes.     

芝芪菌质多糖的制备及其增强免疫活性的初步研究

为研究芝芪菌质多糖体外免疫活性增强作用,本研究采用水提、醇沉、离子交换层析等方法纯化芝芪菌质多糖,并对各多糖组分(GAP-1、GAP-2、GAP-3、GAP-3)进行小鼠脾细胞增殖、NK细胞活性以及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性的测定。结果表明:纯化的4种芝芪菌质多糖在10-3mg/mL～10-1mg/mL浓度范围内均能够显著增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应;在25mg/kg～100mg/kg剂量范围内均能够显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性,而且呈剂量依赖性,其中以GAP-3效果最为明显;对NK细胞活性也有不同程度的增强作用,其中,GAP-3在浓度为100μg/mL时,NK细胞的杀伤率为27%,与IL-2阳性对照组比较,有显著增强作用(p0.05)。本研究证明,纯化的芝芪菌质多糖具有较好的体外增强免疫活性,为芝芪菌质作为增强机体免疫力的饲料添加剂提供了理论依据。