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1.
2.
猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建与筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
在体外将猪带绦虫虫卵孵化为有活力的六钩蚴。采用商品化试剂盒抽提六钩蚴总 RNA、m RNA,反转录为双链c DNA,再加 Eco R Adapter。在去除小片段后 ,dsc DNA与 λgt11噬菌体 DNA连接 ,经蛋白包装 ,构建了猪带绦虫六钩蚴λgt11c DNA文库。该文库效价为 3.5× 10 9pfu/ m L ,重组 DNA片段大小为 0 .5~ 3.2 kb,平均为 1.6 kb,蓝白斑比 1∶ 9。用抗体探针对文库进行免疫学筛选 ,在消除非特异性反应的基础上筛选约 10 6 重组子 ,共得到 118株强阳性克隆 ;应用 PCR鉴定上述部分阳性克隆 ,均扩增到 0 .5 kb以上的片段。结果显示 ,构建的文库合格 ,含六钩蚴所有抗原基因 ,可用于六钩蚴 c DNA克隆的筛选 ;用免疫学与 PCR联合筛选 c DNA文库 ,可消除假阳性 相似文献
3.
4.
Kano R. Kubota A. Nakamura Y. Watanabe S. Hasegawa A. 《Veterinary research communications》2001,25(8):615-622
Using cDNA from a CRFK cell line as a template, PCR amplification was performed with the Ub1S and poly(dT) primers to isolate feline ubiquitin genes. Sequencing of the 495 bp PCR fragment revealed that the putative amino acids induced by this fragment gave a fusion protein consisting of a ubiquitin polypeptide (76 amino acids) and an extension protein of ribosomal proteins L40 (52 amino acids). The putative amino acid sequence of ubiquitin was identical to those of humans, rats and pigs.The recombinant glutathione S-transferase (GST)–feline ubiquitin fusion proteins were produced in Escherichia coli and purified. The fusion proteins had a molecular weight of about 42 kDa and were detected by immunoblot assay with rabbit anti-ubiquitin antiserum.The mRNAs from heat-shocked and non-heat-shocked cells were subjected to RT-PCR (Ub1S and poly(dT) primers) analysis. The molecular weights of the ubiquitinated proteins in heat-shocked CFRK cells were between 18 kDa and 24 kDa by immunoblot assay.These results suggested that there were more ubiquinated proteins in the heat-shocked CRFK cells than in the pre-heat-shocked cells. 相似文献
5.
6.
表达序列标签(ESTs)及其应用 总被引:3,自引:0,他引:3
表达序列标签(ESTs)是指从(ESTcDNA文库中随机挑取克隆并对其3’或5’端进行单轮自动测序所获得的短cDNA库列,一般长度为300~500bp。要有效获取ESTs,必须对cDNA文库进行预处理,处理方法有衰减杂交法、均一化法和差异显示法。在dbEST中收录了大量各种生物的ESTs。ESTs广泛应用于鉴定基因、发现新基因、电子克隆、构建遗传学图谱、制备DNA芯片、分子标记、研究基因的差异表达及检验病原微生物等方面。 相似文献
7.
本文应用聚合酶链反应(PCR)技术从构建的新城疫病毒(NDV)cDNA文库中扩增含编码F糖蛋白前体──Fo酶切位点序列的359bp的F蛋白基因cDNA片段。将此359bpcDNA片段经光敏生物素标记后,即成NDV-cDNA探针。该探针能特异性地从感染的尿囊液中检测出NDV强毒株和疫苗毒株的基因组RNA,而不与IBDv-dsRNA、AIBv-ssRNA、EDS76-dsDNA、MDV-dsDNA,FPV-dsRNA及AILV-dsDNA发生交叉杂交反应。试验结果表明:尽管该探钎含有编码Fo蛋白酶切位点序列的碱基顺序,但它还是不能把NDV的强、弱毒株区分开。这说明NDV强、弱毒株比区域内的碱基存在着相当大的同源性。不过,此探针对NDV来说具有特异性,这就为NDV的诊断技术开创了基因水平检测的新途径。 相似文献
8.
一个马铃薯Y病毒山东分离物的分离与鉴定 总被引:4,自引:1,他引:4
从具有典型花叶症状的马铃薯叶片中分离到马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)(本文称PVY-SD-TA分离物),扩繁后,提纯病毒,电镜下可观察到700~900 nm×11 nm的病毒粒体,病组织超薄切片观察可见风轮状的内含体结构,寄主反应特性研究表明其能侵染2科13种植物。SDS-PAGE电泳检测病毒编码的外壳蛋白亚基的分子量为33 kDa。以PVY-SD-TA基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法和特异引物合成了外壳蛋白基因。对cDNA全序列分析表明,PVY-SD-TA CP基因核苷酸序列与N株系的同源性为96%,与GenBank中登录序列号为AJ390306的O株系分离物的同源性最高,为99%;与国内不同学者报道的PVY中国流行株的同源性分别为96%,97%和98%。通过以上生物学特性和分子水平的研究将PVY-SD-TA鉴定为普通株系(PVYO株系)。 相似文献
9.
结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引:3,自引:0,他引:3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
10.
绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒gag基因的克隆与序列分析 总被引:4,自引:0,他引:4
参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列,设计合成3对引物,对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,分别呈3条531、888和949 bp的特异条带,将其分别克隆人pMD-18T载体中,进行序列测定并拼接序列,得到完整的gag基因序列。分析结果表明,与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为89.0%,推导出的氨基酸同源性为90%。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为86.3%,氨基酸同源性为87%。 相似文献