油菜素内酯和脱落酸调控葡萄果实花色苷合成的研究

【目的】为研究2,4-表油菜素内酯(2,4-epibrassinolide,EBR)和脱落酸(abscisic acid,ABA)处理对葡萄花色苷合成与可溶性固形物含量、果皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)活性以及果实内源ABA含量的影响,探索油菜素内酯调控葡萄果实成熟及花色苷合成的机理。【方法】以酿酒葡萄‘赤霞珠’(Cabernet Sauvignon)和‘烟73’(Yan 73)为试材,在葡萄转色前分别用0.1、0.4、0.8 mg.L-1EBR,1mg.L-1Brz(brassinazole,BR生物合成抑制剂)和200 mg.L-1ABA,均匀喷施于葡萄果实,在葡萄成熟过程中测定葡萄果皮花色苷含量及PAL和UFGT酶活性,同时测定果实ABA和可溶性固形物含量。【结果】在果实着色初期,‘赤霞珠’和‘烟73’葡萄果皮PAL和UFGT活性及果实内源ABA含量均逐渐升高,当果实接近成熟花色苷含量基本稳定时ABA含量开始降低。与对照相比,0.4mg.L-1EBR和200 mg.L-1ABA处理显著增加了果实内源ABA含量,提高了果皮PAL和UFGT活性,促进了果皮花色苷的合成和果实可溶性固形物的积累。0.1 mg.L-1和0.8 mg.L-1EBR处理总体增加了果实内源ABA含量,促进了花色苷的合成和可溶性固形物的积累,并提高了UFGT和PAL酶活性,但比0.4 mg.L-1EBR处理提高的幅度小,且差异显著。1 mg.L-1Brz处理使果实ABA的合成推迟,果实可溶性固形物含量、果皮PAL和UFGT活性以及花色苷含量均低于对照,但差异不显著。【结论】外源EBR和ABA处理促进了葡萄成熟和花色苷合成,在不同浓度EBR处理中,以0.4 mg.L-1处理效果较好;内源ABA可能参与了EBR对葡萄成熟和花色苷合成的调控。     

苹果梨果实着色相关酶基因片段克隆及表达分析

通过RT-PCR技术对苹果梨果实着色相关酶(PAL、CHI、UFGT)基因片段进行了克隆,并且采用半定量RT-PCR技术进行了3种酶基因在不同发育阶段的表达分析。结果表明:苹果梨与其他植物PAL、CHI、UFGT的相同氨基酸和相似氨基酸的百分比都约为90%,分别与鸭梨、砂梨、西洋梨氨基酸序列聚类关系最近;套袋抑制PAL、CHI、UFGT 3种酶基因的表达,去袋后,3种酶基因的表达量明显增加。     

刺葡萄愈伤组织UFGT基因克隆及表达分析

为从细胞水平上揭示刺葡萄3-O-类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)基因调控花青素合成的功能,以刺葡萄愈伤组织为试验材料,根据刺葡萄愈伤组织转录组UFGT序列片段,利用RT-PCR结合RACE技术克隆得到VdUFGT基因,并对其进行生物信息学和表达特性分析。结果表明,VdUFGT基因cDNA和DNA开放阅读框(ORF)分别为1 371 bp和1 448 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码456个氨基酸,为带负电荷的不稳定的亲水性蛋白,具有一个UDPGT结构域,是UDPGT超家族成员,包含UDP-黄酮糖基转移酶特征区域。由UFGT同源基因编码蛋白所构建的系统发育树,与植物进化的关系相一致,6个葡萄属植物聚为一支。RT-qPCR分析表明,刺葡萄红色愈伤组织VdUFGT转录水平极显著高于白色愈伤组织,培养25 d的2个细胞培养物差异可达79倍;在刺葡萄愈伤组织连续培养过程中,红色愈伤组织中VdUFGT转录水平变化幅度较大,在愈伤组织快速生长中期和衰老初期分别出现峰值,而刺葡萄白色愈伤组织VdUFGT转录水平与红色愈伤组织相比变化幅度不大,且始终维持在一个较低的水平。说明VdUFGT对刺葡萄红色愈伤组织细胞培养物中的花青素生物合成有重要的调控作用,这种调控作用主要发生在刺葡萄愈伤组织细胞快速生长中期和细胞衰老初期。本研究结果为进一步阐明VdUFGT调控刺葡萄细胞花青素合成的机制奠定了理论基础。     

桑树类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因的鉴定及主效基因功能分析

根据同源比对,从川桑(Morus notabilis)基因组数据库(morus.swu.edu.cn/morusdb/)中鉴定类黄酮3–O–葡萄糖基转移酶基因(MaUFGT)家族成员。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析MaUFGT在桑树各组织和发育期的表达水平。随着果实发育成熟,MaUFGT1、MaUFGT2和MaUFGT3的表达模式相似,均呈上升趋势;在从顶芽依次向下不同叶位中,3个UFGT基因表达呈现先降低后升高,再降低又升高的趋势;在幼茎皮层和托叶中大量表达,幼茎表皮和木质部、叶柄中表达量较低,有的甚至不表达。MaUFGT2的表达量在3个基因中都是最高的,推测其是该基因家族的主效基因。从桑树品种‘嘉陵40’成熟果实中克隆了UFGT2基因,命名为MaUFGT2,登录号KP455729.1。其c DNA全长为1 386 bp,编码461个氨基酸,推测蛋白质分子量约为51 k D。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守性不高。将MaUFGT2克隆到p ET-28a(+)原核表达载体后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 k D,主要以包涵体形式表达,在上清液中也有少量表达。MaUFGT2蛋白经纯化和复性后,最后通过高效液相色谱(HPLC)分析该蛋白的酶活性,结果表明,体外酶活性鉴定MaUFGT2能够催化UDP葡萄糖转移至槲皮素形成槲皮素3–β–D–葡萄糖苷,验证了其具有糖基转移酶的功能。     

苹果属观赏海棠McUFGT的克隆及其在不同叶色品种间的表达差异分析

为探讨UFGT基因在观赏海棠叶片呈色过程中的作用,以观赏海棠常紫红色类品种‘王族’叶片总RNA为模板,通过RACE扩增,获得一个长度为2 186 bp的cDNA序列,其编码区共1 425 bp,编码475个氨基酸,命名为McUFGT。利用高效液相色谱法和实时荧光定量PCR技术,对3个不同叶色的观赏海棠品种‘王族’（叶片常紫红色类）、‘绚丽’（新叶红色类）和‘火焰’（叶片常绿色类）叶片中的花色素苷含量、McUFGT相对表达量进行测定分析。结果表明,在3个品种中矢车菊色素苷是主要的花色素苷物质,并且随着叶片的生长发育,不同叶色品种间矢车菊色素苷差异显著,其中以叶片常紫红色品种‘王族’矢车菊色素苷积累最多。同时矢车菊色素苷含量的变化与McUFGT相对表达量变化趋势基本一致,说明McUFGT在苹果属观赏海棠叶片花色素苷合成及色泽形成过程中具有重要的作用。     

美国红枫变色期二氢黄酮醇还原酶和类黄酮糖基转移酶变化研究

以美国红枫‘秋天火焰’（Acer×freemanii‘Autumn Blaze’）和‘白兰地’（Acer rubrum‘Brandywine’）为试材，研究美国红枫变色过程中，叶片中花青苷含量及其生物合成相关酶二氢黄酮醇还原酶（DFR）和类黄酮糖基转移酶（UFGT）的活性变化。结果表明：两红枫品种叶片中花青苷含量随叶色的变化为单峰曲线，分别在第20d和25d出现峰值；DFR和UFGT酶活性与花青苷含量均成二次曲线关系；UFGT是秋天火焰和白兰地花青苷合成的关键酶，DFR与秋天火焰和白兰地花青苷合成无关。     

槭树叶片类黄酮糖基转移酶基因RT-PCR扩增体系优化

以槭树"秋天火焰"变色期秋季叶片为试材,采用改良CTAB法提取叶片总RNA,利用GenBank中相关物种的UFGT基因序列设计特异引物,进行RT-PCR扩增并对RT-PCR反应体系中的引物、退火温度和循环次数进行优化,建立了槭树叶片UFGT基因的RT-PCR扩增反应体系。     

荔枝果皮中4种酚类代谢酶活性的测定方法

为了改进酚类物质生物合成途径中关键酶酶活性的测定方法,以南方重要常绿果树荔枝 Litchi chinensis 果皮为材料,采用两点法和酶动力法2种酶活性研究方法,结合分光光度法和高效液相色谱法检测产物浓度变化,优化了4种酚类代谢常见酶［包括苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查儿酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)］的测定方法,指出了酶液的纯化、酶活性的保护以及反应底物的溶解方法等对试验结果的稳定性和可靠性的影响,介绍了试验过程中常遇到的问题和具体的解决方法以及试验过程中的注意事项.应用改进后的方法测定荔枝发育过程中果皮PAL、CHI、DFR和UFGT的酶活性,结果发现活性变化趋势与前人的报道基本一致.改进的PAL、CHI、DFR和UFGT酶活性的测定方法可靠,可为相关的研究提供重要的参考.     

槭属2品种叶变色期花青苷含量与相关酶活性的变化

以自由人槭'秋天火焰'和红花槭'白兰地'为试材,研究槭属品种变色过程中(10月12日-11月19日),叶片花青苷含量及其生物合成相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查儿酮异构酶(CHI)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)和类黄酮糖基转移酶(UFGT)的活性变化.结果表明:2个品种叶片中花青苷含量随叶色的变化为单峰曲线,分别在第20和25天出现峰值;PAL,DFR和UFGT酶活性与花青苷含量均成2次曲线关系,CHI酶活性与花青苷含量呈极显著的线性关系;PAL,CHI和UFGT是'秋天火焰'花青苷合成的关键酶,CHI和UFGT是'白兰地'花青苷合成的关键酶.     

花青苷的研究进展

花青苷是一种重要的植物天然色素,本文依据有关文献,简要说明了花青苷的结构、提取鉴定方法以及生物合成途径,并从生物化学和基因调控的角度重点介绍了PAL、CHS、DFR和UFGT在花青苷合成中的重要作用,归纳了其他植物色素、碳水化合物、内源激素以及光照和温度在花青苷合成过程中的调节作用,同时指出,关于光敏色素调节酶活性机理以及基因调控花青苷合成模式的研究是揭示花青苷合成机制的关键,为今后的科研提出了研究重点和方向。