茶树硝酸根转运蛋白基因NRT2.5的克隆及表达分析

通过RACE克隆从茶树[Camellia sinensis (L.)]叶片中获得NRT2.5基因cDNA全长序列。所得基因序列全长为2 457 bp,其中开放阅读框为1 362 bp,编码454个氨基酸,推测蛋白分子量为48.7 kD,理论等电点为9.63。生物信息学分析表明,该基因与可可树、拟南芥等的NRT2.5基因具有高度同源性,且其编码的蛋白质具有NRT家族共有的结构特征。实时定量PCR分析表明,NRT2.5基因在茶树不同组织中均有表达,但主要在成熟叶和根中表达;不同氮浓度处理后,茶树NRT2.5基因在低浓度下的表达量高于高浓度下。     

植物NRT2家族的分子进化

为了研究硝酸盐转运子NRT2家族在植物中的进化关系,综合利用共线性信息和序列相似性信息,从8种已经进行过全基因组测序的物种(大白菜、大豆、杨树、葡萄、玉米、水稻、高粱、二穗短柄草)中,搜索拟南芥NRT2的同源基因。通过分析发现,这些基因序列基本都具有MFS超家族的NNP家族基因的典型特征。但单、双子叶植物之间,NRT2的基因结构存在着较大的差异。系统发育重建结果表明,NRT2基因家族的成员主要是在单、双子叶植物分歧后进化产生的;同时,不同植物的NRT2基因又具有不同的进化模式。大白菜NRT2家族经历了基因组三倍化事件及基因片段丢失。因此,拟南芥和大白菜的NRT2家族有较为密切的进化关系,进化分析为利用已有的拟南芥NRT2研究结果进一步在大白菜中开展NRT2的功能研究提供了参考线索。     

草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的克隆及表达分析

植物硝酸盐转运蛋白（Nitrate transporter，NRT）可有效转运NO₃^-，提升氮素利用效率。为了解析草地早熟禾（Poa pratensis）适应不同浓度及不同形态氮素、干旱胁迫机理，本研究以草地早熟禾为试材，对NRT1/PTR FAMILY 8.3基因进行克隆、生物信息学分析，并分析了不同浓度及不同形态氮素以及干旱下该基因表达情况。研究结果：草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因包含典型的主要协同转运蛋白超家族（Major facilitator superfamily，MFS）结构域，与二穗短柄草（Brachypodium distachyon）高度同源；荧光定量PCR分析表明，该基因根部、叶部的表达量显著高于茎部；氮浓度为7.5 mM时，不同形态氮素诱导下，NaNO₃处理组有利于该基因表达；无氮、高氮组（0，15 mM NaNO₃）基因的表达量显著高于适氮组（7.5 mM NaNO₃）；干旱胁迫可促进其表达。研究结果为探究NRT1/PTR FAMILY 8.3在不同氮素环境中的调节机制，培育氮素利用率高的优质草种提供理论基础。     

木薯MeNRT2.1基因的克隆及表达分析

木薯具有产量高、抗贫瘠等特点,为了了解其耐贫瘠的作用机理,提高木薯在贫瘠土壤中对氮素的利用率,以培养20 d的"华南5号"木薯组培苗为实验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,获得一个高亲和硝态氮转运蛋白(NRT2)基因,命名为Me NRT2.1,该基因含有1 593 bp的开放阅读框架,编码530个氨基酸。生物信息学分析结果表明,木薯Me NRT2.1与苜蓿、拟南芥、可可、杨树等物种的NRT2.1同源性高,其中与可可树Tc NRT2.1的亲缘关系最近,氨基酸相似性达到90%。实时荧光定量PCR检测结果表明,Me NRT2.1在木薯组培苗的根中表达,并且在NO_3~-浓度为0.2 mmol/L时,其相对表达量较高,NO_3~-浓度为10 mmol/L时其相对表达量较低,NO_3~-浓度为0时几乎不表达;Me NRT2.1在茎、叶中也几乎不表达,即该基因具有诱导型组织特异性表达模式。原生质体瞬时表达发现Me NRT2.1定位在细胞膜上。此研究为进一步通过NRT2基因提高木薯的抗逆性奠定了基础。     

NRT1.7基因突变对拟南芥硝酸盐再分配及氮效率的影响

以NRT1.7突变体(nrt1.7-3)和哥伦比亚野生型植株(col.0)为材料,研究NRT1.7基因对植株产量和氮素利用效率(NUE)的影响。结果表明:在花期、角果期nrt1.7-3突变体叶片SPAD值显著升高,出现滞绿现象;与幼嫩叶片相比,硝酸盐更多地累积在老叶中;nrt1.7-3植株在花期、收获期的生物量、产量和氮效率均显著下降。     

白菜NRT2基因的克隆及表达模式分析

 以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）品种‘苏州青’为试材,采用RT-PCR技术,获得1个高亲和硝酸盐转运蛋白基因（NRT2）的cDNA序列,全长1 593 bp,推断其编码530个氨基酸,命名为BcNRT2。序列分析表明：BcNRT2基因与甘蓝型油菜BnNRT2基因和拟南芥AtNRT2.1基因核苷酸序列的相似性分别为98%和90%,氨基酸序列的相似性分别为99%和95%,表明植物中NRT2基因保守度较高。实时定量PCR表达分析表明,BcNRT2在白菜根部的表达量最高,为诱导型表达。低浓度NO^₃-（0.2 mmol · L^-1 KNO₃）处理0.5 h后其表达量迅速上升,BcNRT2可能为NO₃^-感受器。高浓度NO₃^-（20 mmol · L^-1 KNO₃）处理后其表达量更高,持续时间较长,可能是受到低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1.1的调控而产生的高水平响应。原生质体的瞬时表达显示,BcNRT2蛋白位于细胞膜上。     

ACC对不同氮效率油菜生长后期硝态氮再利用的调控机理

【目的】研究了进一步解析乙烯对油菜生长后期硝态氮 (NO₃–) 再利用的影响,揭示植株生长后期氮素再利用的生理机制。【方法】以氮高效油菜品种湘油15 (27号) 与氮低效油菜品种814 (6号) 为试验材料,在15 mmol/L氮水平下,每7天浇灌一次50 mL 100 μmol/L 1-氨基环丙烷-1-羧酸 (1-am-inocyclopropane-1-carboxylic acid,简称ACC),研究ACC对植物生长后期 (花期、收获期) 氮素再利用的影响及其与氮素利用效率 (NUE) 的关系。并用拟南芥野生型 (col.0) 和突变体 (nrt1.5) 材料作为验证,分别于玻璃顶网室和22℃恒温培养室进行砂培试验。【结果】ACC处理显著抑制了油菜BnNRT1.5的表达,且植株的衰老可以显著诱导BnNRT1.5的表达。相对于对照处理,ACC处理植株韧皮部汁液NO₃– 的再转运能力显著降低,导致下部叶NO₃– 含量显著升高,中部叶NO₃– 含量显著下降,上部叶NO₃– 含量无显著变化,进而导致植株含氮量和籽粒含氮量显著提高,以及以生物量和籽粒产量为基础的氮素利用效率 (NUE) 显著降低。由此推测,油菜生长后期氮素的再利用能力受到NRT1.5基因的显著调控。拟南芥野生型和突变体材料的验证结果表明,相对于拟南芥野生型 (col.0) 材料,拟南芥nrt1.5植株生长后期相对于col.0有更多的NO₃– 累积在植株衰老叶片中,更少的NO₃– 通过韧皮部转运到生长旺盛的新叶,植物生长后期氮素从老叶向新叶转运的再利用能力显著降低。【结论】油菜生长后期氮素的再利用能力受到ACC的显著调控,油菜和拟南芥NRT1.5基因表达量分别受到抑制或者发生基因突变时,会导致植株韧皮部汁液NO₃– 再转运量减少,更多NO₃– 累积在衰老叶片中而不能得以高效的再利用。因此,调控油菜生长后期NRT1.5的表达,提高油菜生长后期氮素的再转运和利用可以作为提高氮素利用效率的有效手段。     

蔗糖对拟南芥根系偏斜角度的影响

本文以野生型拟南芥Col-0及NRT1.1突变体nrt1.1-1和chl1-5为材料,通过在培养基中添加不同浓度的蔗糖,研究了蔗糖对拟南芥根系偏斜程度的影响.结果表明,0,3％蔗糖处理野生型与突变体拟南芥的根系偏斜角度有显著性差异,突变体根系偏斜角度分别是野生型的1.34-1.80倍(nrt1.1-1)和1.71-2....     

高羊茅硝态氮转运蛋白基因NRT1.1的克隆及表达模式分析

为探究高羊茅(Festuca arundinacea)硝态氮转运蛋白基因(NRT1.1)的表达模式,本研究以黔草1号高羊茅为试验材料,采用RACE和RT-qPCR技术对高羊茅NRT1.1基因的cDNA全长序列进行扩增,并对其不同胁迫处理下的表达情况进行分析。生物信息学分析发现,高羊茅NRT1.1的理论等电点为4.81,平均亲小性为0.919,含有约32.63% α-螺旋、7.63% β-转角和53.73%不规则卷曲。结果表明,NRT1.1基因的cDNA序列全长为2 328 bp,编码606个氨基酸,预测蛋白质分子量为193.9 kDa,且高羊茅NRT1.1与黑麦草NRT1.1氨基酸序列的相似性最高。RT-qPCR表达分析发现,高羊茅叶片NRT1.1受低氮处理0.5~1 h时表达量达到峰值,显著(P< 0.05)高于对照组;在干旱和热处理下,NRT1.1表达量分别在6 h和12 h时达到峰值,且显著(P< 0.05)高于对照组;在盐处理下,仅在6 h时NRT1.1表达量高于对照组,其余时间均受显著(P< 0.05)抑制。本研究结果为解析高羊茅NRT1.1基因的表达模式提供了分子生物学基础。     

花生高亲和硝酸盐转运蛋白基因AhNRT2.7a响应低氮胁迫的功能研究

【目的】 氮素在作物生产中对生物量和产量起关键作用。高亲和硝酸盐转运蛋白基因NRT2在植物响应低氮胁迫时被激活并具有维持氮吸收和转运的作用。通过筛选花生低氮耐受相关的NRT2基因并解析其生物学功能,为培育高氮素利用率的花生新品种提供理论参考,最终有助于实现节氮、高效的绿色生产目标。【方法】 检测正常氮浓度及1/20正常氮浓度（15 mmol·L^-1）条件下5个具有典型跨膜结构的花生NRT2基因（AhNRT2.4、AhNRT2.5b、AhNRT2.5c、AhNRT2.7a和AhNRT2.7b）的时空表达情况。以花育6309的cDNA为模板,对AhNRT2.7a进行克隆和生物信息学分析,并通过亚细胞定位确定AhNRT2.7a的表达部位。进一步构建异源过表达AhNRT2.7a的拟南芥株系,分别在正常以及低氮胁迫条件下测定其叶绿素含量、氮积累量以及谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（NiR）、谷氨酸脱氢酶（GDH）5个氮代谢关键酶的活性。【结果】 5个NRT2基因中有4个NRT2基因在花生响应低氮胁迫条件下大量表达。其中,AhNRT2.7a能够响应低氮胁迫,并在花生茎和叶中高表达。获得AhNRT2.7a的cDNA序列,全长为1 380 bp,编码459个氨基酸。蛋白结构分析显示其为具有12个典型跨膜结构域的膜蛋白。该氨基酸序列与栽培种花生（Arachis hypogaea L.）相似性高达99.56%,其次是野生亲本AA和BB基因组花生。亚细胞定位显示其主要定位于细胞质膜上。构建异源过表达AhNRT2.7a的转基因拟南芥植株,在不同供氮条件下,成熟叶和幼叶叶片的叶绿素相对含量均显著高于野生型拟南芥。同时,对上述5个氮代谢相关酶活性以及氮、磷、钾积累量测定显示,转基因植株中2个氮代谢相关酶（GS和NR）的酶活性以及氮积累量均比野生型拟南芥有显著升高。【结论】 花生中4个NRT2基因响应低氮胁迫,其中AhNRT2.7a能够提高植物氮代谢过程的氮素利用率。AhNRT2.7a的表达在促进氮代谢过程的同时,促使碳代谢作用的进一步加强。因此,AhNRT2.7a适合作为花生氮素高效利用为目的的候选基因。