富含多糖的转基因石斛基因组DNA提取方法(英文)

在石斛兰转基因研究中,需通过PCR和Southern杂交等手段检测外源基因是否转入并整合到转化植株基因组.由于转化石斛植株生长缓慢,且含有多糖,因此从转化植株中提取高质量的基因组DNA以尽快对转基因苗进行分子检测存在较大困难.本研究旨在通过改良现有的DNA提取法(CTAB法或SDS法1,克服转化石斛植株基因组DNA提取中碰到的产量低,纯度不高而导致难以进行PCR或酶切等问题.在本研究所用的3种改良法中,方法Ⅱ能从少量的转化石斛苗中提取出高产量和高纯度的基因组DNA.研究结果表明方法Ⅱ提取的基因组DNA完全适用于转基因石斛的外源基因PCR扩增,限制性酶切和Southern杂交分析.     

p5CS基因在蒙农杂种冰草植株中的表达及耐盐性研究

为尽快培育出适宜我国干旱荒漠地区大面积推广的耐盐冰草新品种,试验以经PCR和Southern blot杂交检测的含有p5CS基因的蒙农杂种冰草植株为材料,用Northern blot检测目的基因在转化植株中的表达;并用1.5%NaCl盐溶液进行胁迫处理确定转化植株的耐盐性。结果表明:转基因冰草植株与DIG标记探针杂交呈现明显的杂交带;盐胁迫下,游离脯氨酸含量增加较快,质膜透性、丙二醛含量增加较小,SOD活性较高。说明p5CS基因能够在冰草基因组的转录水平上表达,表达植株的耐盐性明显增加。     

心肌型脂肪酸结合蛋白的纯化及亲和配体的研究

利用盐析、G-75凝胶过滤层析和DEAE-葡聚糖纤维素离子交换层析技术,从牛心中分离出心肌型脂肪酸结合蛋白,经SDS-PAGE鉴定与免疫印迹(Western blot)分析,获得了纯品H-FABP。采用噬菌体随机展示七肽库,以H-FABP为靶标,对其亲和配体进行筛选,结果获得了与H-FABP有特异性亲和作用的配体序列,为其临床检测急性心肌梗塞新方法的建立奠定了基础。     

应用Dot PPA ELISA检测猪布氏杆菌病抗体的研究

本试验以布氏杆菌ＳＡＴ 为对照试验,建立了Ｄｏｔ ＰＰＡ ＥＬＩＳＡ 检测猪布氏杆菌病抗体的方法,该法检测的猪ＩｇＧ 含量可达６９９２×１０－ ９ｇ,灵敏性高,不同猪抗ＰＲＶ、ＰＰＶ、ＨＣＶ、ＪＥＶ、ＣＨＬ 等阳性血清发生交叉反应,特异性强;此外该法还具有操作简便、快捷不需特殊试验条件、结果客观、肉眼易于判断、反应膜片可长期保存等优点。适宜在广大基层单位应用,对布病的快速诊检有着十分重要的意义。     

水稻转录因子OsWRKY68蛋白质的表达特征及其功能特性

【目的】 水稻中有近百个WRKY转录因子家族成员,其中很多与生长发育、生物与非生物逆境胁迫应答有关。河北农业大学生命科学学院分子生物学与生物信息学实验室（molecular biology & bioinformatics lab,MBB）前期发现OsWRKY68在水稻接种白叶枯病菌后诱导表达,本研究试图进一步探究OsWRKY68的功能。【方法】 采集水稻TP309不同生长发育时期的组织样品,包括萌发期、幼苗期、分蘖期、孕穗期和开花期的根、茎、叶、叶鞘、叶枕、穗子、花药、颖壳和种子,以及非生物胁迫（4℃、44℃、48℃、淹、NaCl、PEG、恒光和恒暗）和激素处理（脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸和乙烯利）的叶片,提取总蛋白质,用水稻OsWRKY68蛋白质特异抗体,通过免疫印迹（western blot,WB）技术系统调查OsWRKY68蛋白质在水稻正常发育过程中不同时期、不同组织、非生物胁迫及激素处理条件下的表达特征。构建RNAi载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻TP309,对转基因植株进行PCR和WB鉴定,观察OsWRKY68 RNAi转基因植株的表型并测量其株高、分蘖数、穗长、小穗数和结实率等性状。【结果】 调查OsWRKY68蛋白质的表达丰度,发现OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育过程中基本呈组成型表达,且在大部分组织中表达丰度差异倍数不大,但在开花期的花药中OsWRKY68表达量高于成熟穗、穗轴和颖壳;在分蘖期和孕穗期的叶鞘中不表达,仅在开花期的叶鞘中表达;在孕穗期的幼穗中,随着幼穗长度的增加其表达丰度逐渐降低。调查水稻非生物胁迫和激素处理后OsWRKY68蛋白质的表达特征,发现盐胁迫后OsWRKY68蛋白质的表达丰度随时间延长持续下降,恒光处理后OsWRKY68蛋白质表达量持续上升,3 d时明显出现一条分子质量较大的条带（记作OsWRKY68 ⁺）,且表达量逐渐增加,茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）和乙烯利（ethephon,ET）处理后同样也呈现OsWRKY68 ⁺蛋白质丰度的增加。对转基因植株进行鉴定和自交繁殖,对T₃代的4个OsWRKY68 RNAi转基因株系（Y316、Y317、Y326和Y337）进行PCR和WB鉴定,均表现阳性。在转基因植株中,OsWRKY68蛋白质的表达量均低于野生型TP309。对转基因植株进行表型观察和性状测量,发现与野生型相比转基因植株的株高降低、分蘖数和结实率下降等。 【结论】 OsWRKY68蛋白质在水稻正常生长发育中发挥作用,敲低OsWRKY68蛋白质的表达能影响水稻的正常生长。OsWRKY68蛋白质可能参与盐、光照、茉莉酸甲酯和乙烯介导的信号转导过程。     

水稻线粒体基因编码蛋白质在种子萌发及叶片发育过程中的表达分析

线粒体是真核生物中主要的能量供应细胞器,虽然多种植物的线粒体基因组序列已知,但对线粒体基因编码蛋白质的表达研究关注甚少。本研究采取基于抗体的蛋白质组学策略,制备了17个线粒体基因编码蛋白质的特异性抗体,包括NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶、细胞色素C合成酶、ATP合酶和核糖体蛋白质等5类,利用免疫印迹技术(Western blot)调查了这些蛋白质在水稻种子萌发及不同生长发育时期叶片中的表达情况。结果发现,在种子萌发阶段,ATP合酶中的亚基9和核糖体蛋白质S13亚基表达上调,细胞色素C合成酶CCMB和CCMC表达下调,其余13个表达没有发生变化。在叶片发育阶段,15个蛋白质发生表达上调,且表达模式基本相似,均呈现前期较低,随发育逐渐提高,到成株期达到峰值,其中部分蛋白质在成熟期仍维持在较高的峰值强度(如NAD4、CCMFc、ATP9、RPS1、RPS4和RPS7),提示这些蛋白质在成熟后的灌浆期仍发挥一定作用,而其余蛋白质在成熟期表达量明显下降,提示其功能主要是在营养生长阶段发挥。有意思的是,在叶片发育阶段,RPS19蛋白质表达下调,ATP1蛋白质的表达稳定,它们的特征和功能值得进一步关注。本试验结果直观且相对定量地揭示了线粒体基因编码蛋白质的表达与种子萌发和叶片生长之间的关联,为深入了解其功能提供了有价值的线索。     

水稻纹枯菌总 DNA 提取方法的比较

DNA的浓度,尤其是DNA的纯度严重影响后续基因组酶切等结果。为寻找一种高质量的水稻纹枯菌总DNA的提取方法,采用CTAB法、CTAB改良法、SDS法、蜗牛酶法、蛋白酶K法5种方法分别提取水稻纹枯菌总DNA。通过紫外吸光度测定DNA的纯度和浓度、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增、限制性内切酶酶切反应及Southern杂交评价DNA的质量,最终得出蛋白酶K法是获取高质量水稻纹枯菌基因组DNA的最佳方法。     

热水处理防治甘蔗宿根矮化病的效果及对再生植株影响研究

甘蔗宿根矮化病(Ratoon Stunting Disease,RSD)在我国蔗区普遍发生,研究其防治方法十分必要。应用50℃2 h热水处理严重感染RSD的粤糖00-236,新台糖22号种茎,用斑点酶标记免疫试验(Dot blot en-zyme immunoassays,DB-EIA)检测RSD病原菌(Leifsonia xylisubsp.xyli,Lxx),研究热水处理脱菌效果;并以粤糖00-236热水处理种茎与未处理种茎进行田间对比试验,研究热水处理对种茎再生植株的影响。结果表明:50℃2 h热水处理种茎可极显著的杀死感病种茎中的RSD病原细菌Lxx,对RSD有较好的防效,但不能彻底去除感病种茎中的Lxx。与未经热水处理种茎再生植株相比,经热水处理的粤糖00-236感病种茎再生植株的茎长、节间长度、一茎重显著增加,有效茎数极显著增多,生长速度加快,蔗茎产量增加23.2%,但成熟期甘蔗品质几乎无差异。另外,热水处理对种茎蔗芽有损伤,降低了种茎萌芽率。结果表明:50℃2 h热水处理甘蔗种茎能有效的防治甘蔗RSD,促进甘蔗生长,具有显著的增产效应。     

犬血清IgG的纯化、抗体制备及其鉴定

[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。