‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性与CCoAOMT 表达量分析

 为了探讨‘砀山酥梨’芽变品系‘锈酥’果皮褐色形成机理,采用分光光度法测定盛花后25、50、75、100、125、150和175 d果皮中木质素含量和相关酶活性变化;从构建的‘锈酥’正向SSH-cDNA文库中筛选出与木质素生物合成密切相关的CCoAOMT-EST,通过实时荧光定量PCR测定了‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中CCoAOMT的相对表达量。结果表明：‘锈酥’果皮发育前期木质素增量较大,且木质素增量累计比‘砀山酥梨’高12.2%;‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中PAL、4CL、CAD酶活性均在花后75 d达到最大值,而POD酶活性则在花后125 d出现高峰;二者果皮中4种酶活性变化趋势基本一致,但‘锈酥’果皮中均相对较高;‘锈酥’果皮中的PAL和4CL酶活性与木质素增量变化均呈显著正相关,而‘砀山酥梨’则未呈现出此规律;在果实生长发育各个时期,‘锈酥’果皮中CCoAOMT相对表达量均高于‘砀山酥梨’。因此推测,‘锈酥’果皮褐色形成与果皮中木质素积累及相关酶活性提高有关,果皮中CCoAOMT的增量表达是‘锈酥’果实褐皮形成的重要原因之一。     

棉花甲基化酶基因COMT和CCoAOMT的组织特异性表达分析

本研究利用半定量RT-PCR分析方法探索了陆地棉(Gossypium hirsutum L.)木质素合成途径中甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在不同组织和不同发育时期纤维中的表达情况。结果表明COMT1,COMT2,COMT3和CCoAOMT1,CCoAOMT2在棉花的7个组织器官(根、茎、叶、子叶、花瓣、雄蕊、胚珠)中都有表达,其中COMT1和CCoAOMT1在各组织中的表达趋势类似,COMT2,COMT3和CCoAOMT2表达趋势各异。在5～25d的棉纤维发育过程中,COMT1和COMT3表达稳定,COMT2表达量逐渐增加。而CCoAOMT基因家族的2个基因的表达量变化相对明显,CCoAOMT1在25d出现表达高峰,CCoAOMT2则在10d和15d呈现高表达量。本研究表明甲基化酶基因家族COMT和CCoAOMT在棉花的根,茎等维管组织中具有相对一致的高表达量,而在其他组织和发育纤维中则呈现出明显的组织特异性和纤维发育时期特异性。     

‘砀山酥梨’果实CCoAOMT基因的克隆与表达分析

[目的]通过克隆‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri ‘Dangshansuli’)果实中咖啡酰-辅酶AO-甲基转移酶(CCoAOMT)基因的全长序列,并对其进行生物信息学及基因表达差异分析,阐释了其在梨果实木质素合成途径的作用,以期为今后利用基因调控技术来改变果实中石细胞含量从而改善梨果实品质提供一定的理论依据。[方法]以15年生‘砀山酥梨’果实为试材,根据从NCBI数据库中搜索得到关于植物木质化的CCoAOMT基因序列与梨基因组数据库调取的序列比对,利用RT-PCR技术克隆得到了木质素生物合成途径中的一种关键酶基因PbCCoAOMT,GenBank登录号为KJ577544。[结果]该基因全长1133bp,具有1个744bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列比对及系统进化树分析表明:CCoAOMT酶是氧甲基转移酶类,与其他植物CCoAOMT编码的蛋白序列有较高的相似性,尤其与枇杷的相似度最高,达到98.79%,且亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对其在果实不同发育时期表达模式的分析发现,基因表达量呈先上升后下降的趋势,与梨果实中石细胞含量的变化趋势相似。[结论]初步认为从‘砀山酥梨’中克隆得到的PbCCoAOMT基因可能参与了梨果实中木质素的代谢。     

反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成

[目的]研究木质素的生物合成及调控,降低木质素的含量或改变其组分。[方法]用农杆菌介导法将苎麻反义CCoAOMT基因导入烟草,采用PCR及Southern印迹对获得的转基因植株进行分子检测,并测定移栽3个月转基因植株Klason木质素及纤维素含量。[结果]转基因烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低了16.8%,纤维素平均含量升高了15.2%,并且植株生长正常。[结论]抑制植物CCoAOMT表达是反向调控转基因植物木质素生物合成的有效途径。     

抑制CCoAOMT表达对烟草木质素生物合成的影响

 通过农杆菌介导法将毛白杨CCoAOMTcDNA反向导入烟草。PCR、PCR Southern和Northern点杂交检测表明 ,CCoAOMTcDNA已反向整合到烟草基因组中并在转录水平表达。将转基因株系移栽温室 3个月后 ,以Klason法测下部茎木质素含量。与对照相比 ,大部分转基因株系木质素含量均有不同程度的下降 ,其中下降最多达 37%,表明抑制植物内源CCoAOMT的表达可有效地降低木质素含量。     

杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析

利用CODEHOP设汁CCoAOMT基因的简并引物,通过RT-PCR的方法,从杉木茎段中克隆到1个长度为614 bp的PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,序列通过同源性比对后显示该片段与其它植物的CCoAOMT基因具有较高的同源性.利用生物信息学方法分析发现,该序列在112～651 bp片段上有一个开放性阅读框,该序列编码的是一个酸性蛋白,亲水性较弱.疏水性较强;信号肽序列为第23位至第45位,二级结构以α-螺旋(40.62%)与不规则盘绕(45.31%)为主,没有发现β转角区域.     

分离克隆苎麻CCoAOMT基因部分序列

以苎麻[Boehmeria nivea（L.）Gaud]为材料，研究木质素代谢的关键酶苎麻咖啡酰辅酶A甲基转移酶基因序列。分离了高纯度RNA和DNA。以RNA为模板，用简并引物以RT-PCR的方法，克隆了苎麻CCoAOMT基因cDNA部分序列，长度为486 bp，编码162个氨基酸残基。此cDNA序列为苎麻植物中首次克隆的(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase，CCoAOMT)新基因序列。GenBank注册，登录号为AY651026。以苎麻4个栽培品种基因组DNA为模板，经温度梯度PCR条件优化，获得苎麻CCoAOMT基因的部分基因组序列，GenBank注册号为AY818191 (湘苎3号，922 bp)、AY822619 (圆麻，915 bp)、AY822620 (芦竹青，914 bp)、AY822622 (青麻，914 bp)。生物信息学分析结果发现，苎麻4个栽培品种的CCoAOMT基因基因组DNA片段序列有一定的差异。     

抑制咖啡酰-辅酶A甲基转移酶(CCoAOMT)表达的转基因多年生杨树检测与分析

本文以生长4年的转反义CCoAOMT基因的白杨杂种（欧洲山杨与银白杨,Populus tremula x Populus alba）及野生型对照为实验材料,测定Klason木质素含量并分析了木质素组分,结果表明转基因植株木质素含量经历4个生长季后,依然比对照降低13%,同时转基因植株木质素组分的G/S比比对照轻微降低。对茎杆切片显微观察表明转基因植株中部分导管向内凹陷,存在轻度变形。转基因植株与野生型对照在株高、胸径等外部生长形态上没有明显差别。