黑曲霉固体发酵产木聚糖酶的响应面优化设计及其酶学性质的研究

本研究采用响应面法的中心组合对影响黑曲霉(aspergillus niger JL 15)固体发酵产木聚糖酶的条件进行了优化.以橘皮粉为基质,补充碳源、氮源,以及含水量和发酵时间对木聚糖酶产量具有显著影响(P<0.05).模拟二次多项式回归预测模型,并建立自变量与响应值的回归方程,获得各因素的最佳水平,即:甘油、硫酸铵的添加量分别为4.2%和3.1%,含水量为61%,发酵时间为73.4 h,木聚糖酶活性最大预测值达922.9 U/g干发酵产物,验证值为917.7 U/g干发酵产物,高出基础培养基酶活3.2倍.酶学性质分析研究表明,黑曲霉木聚糖酶(XylA)的最适温度和最适pH分别为55oC和pH 5.0.XylA的K_m和V_(max)值分别为9.24 mg/mL和54.05 μmol/min/mL.Mn~(2+)、Zn~(2+)和斗和Mg~(2+)对XylA活性具有促进作用,而Fe~(3+)和cu~(2+)对XylA活性具有明显抑制作用.HPLC分析结果表明,XylA的水解桦木木聚糖和麸皮不溶性木聚糖的产物均为木糖至木六糖,主要产物为木三糖.     

低聚木糖主要成分的核磁共振分析

采用核磁共振波谱分析技术,利用核磁共振碳谱、核磁共振氢谱和二维(2D)核磁共振,通过样品与木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖标准品的图谱对比分析,确定低聚木糖混合物中各组分的1H和13C的准确归属。结果表明,木聚糖糖苷键数量越多,中间糖的共振峰强度会越大。低聚木糖样品中主要成分为木二糖、木三糖等糖链很短的低聚糖。     

木聚糖酶法制木二糖和木三糖的纯化及结构表征

采用聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-2对酶解法制备的低聚木糖混合液中的木二糖和木三糖组分进行了初步分离,并采用相同的层析介质对粗木二糖和木三糖组分进行了纯化,获得了纯度约为97%的木二糖组分和纯度约为94%的木三糖组分.糖基组成分析结果表明该木二糖和木三糖组分均不含阿拉伯糖基,电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析表明该木二糖和木三糖组分的相对分子质量(Mr)分别为282和414,不含乙酰基、阿拉伯糖基或4-O-甲基葡萄糖醛酸基.木二糖组分的13CNMR图谱证实,木二糖组分不含任何取代基.由实验可知,该木二糖和木三糖组分分别是由2个和3个木糖单元以β(1→4)糖苷键连接而成的均一寡糖,不含任何取代基.     

木二糖和木三糖的分离及其用于双歧杆菌的体外培养

采用凝胶过滤层析技术获得了高纯度木二糖和木三糖,并研究了它们在体外对青春双歧杆菌的增殖效果.以聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P-2)为层析介质,采用快速蛋白液相层析(FPLC)系统为平台,以脱气高纯水洗脱,制备分离了木二糖和木三糖,并分别以它们为碳源,研究了体外增殖培养青春双歧杆菌的生长历程.结果表明,体外培养48 h后,木糖、木二糖和木三糖分别将青春双歧杆菌菌体浓度从0.10 g/L增殖至0.16、0.33和0.47 g/L,木三糖对青春双歧杆菌的增殖效果最好,木二糖次之,木糖的增殖效果不明显.木二糖和木三糖在体外培养青春双歧杆菌48 h后,能分别将体系的pH值从7.0降到4.40和4.42.     

低聚木糖主要成分的核磁共振分析

采用核磁共振波谱分析技术,利用核磁共振碳谱、核磁共振氢谱和二维(2D)核磁共振,通过样品与木二糖、木三糖、木四糖、木五糖、木六糖标准品的图谱对比分析,确定低聚木糖混合物中各组分的1H和13C的准确归属.结果表明,木聚糖糖苷键数量越多,中间糖的共振峰强度会越大.低聚木糖样品中主要成分为木二糖、木三糖等糖链很短的低聚糖.