斑马鱼中脑微细结构及相关免疫组化反应

为深入了解斑马鱼中脑的微细结构,采用光镜技术对斑马鱼中脑结构进行观察研究,并利用免疫组化反应显示脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和CD34的分布特征。选用成年AB型斑马鱼,对其中脑连续切片后进行HE染色。观察辨认中脑神经核团结构,包括有视顶盖、半环枕、被盖、中央层、边缘层、纵枕等十多个核团,并与其他鱼类进行比较,根据试验结果绘制出斑马鱼中脑结构概念图。免疫组化试验观察BDNF和CD34都分布在斑马鱼中脑视顶盖边缘层和中央层交界处。本次结果可为斑马鱼神经生物学模型的建立与应用提供有效的理论基础。     

两个Sox9基因在斑马鱼胚胎发育和成体性腺中的动态表达特征

通过整体原位杂交和切片原位杂交技术系统全面地比较分析了斑马鱼胚胎四个发育时期(12、24、48 hpf和4 dpf)和成熟性腺中Sox9a和Sox9b基因的表达模式。结果显示,两个Sox9基因在脑和眼中持续表达,但在耳囊、头部软骨、胸鳍芽和体节中差异性表达。Sox9a特异性地在侧线、尾部神经嵴、原肾管和精巢支持细胞中表达,而Sox9b在卵巢的卵黄颗粒中大量表达。与已发表的研究结果相比,本研究更广泛地揭示了Sox9a和Sox9b的动态差异表达模式,且更清楚地显示了其在性腺中的表达特征。     

草鱼全基因组序列图谱绘制完成

<正>中国科学院水生生物研究所、中国科学院国家基因研究中心、中山大学等机构的研究人员,合作完成了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)基因组序列草图的绘制,相关研究成果在5月4日的《自然·遗传学》杂志上在线发表(The draft genome of the grass carp(Ctenopharyngodon idellus)provides genomic insight into its evolution and vegetarian diet adaptation)。该研究采用鸟枪法测序策略,分别对一尾雌     

斑马鱼模型在胚胎心脏发育研究进展

斑马鱼作为一种模式生物,具有容易饲养,产卵量大,身体透明,体外受精和发育的特点,且心脏发育和人类极为相似。近年来,在心脏发育研究中越来越受到重视,对心脏发育的基础性研究有巨大的推动作用。本文主要综述了近几年来斑马鱼模型在胚胎发育研究进展,尤其是在毒性评估方面的研究进展。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

嘧菌酯与三种外源硒对不同生命阶段斑马鱼的联合毒性

分别测定了嘧菌酯、3种外源硒 (亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒) 对水体模式生物斑马鱼不同生命阶段的单一急性毒性,以及等毒性配比的二元混合体系的联合急性毒性,并分别采用相加指数 (AI) 法、毒性单位 (TU) 法和混合毒性指数 (MTI) 法对其联合效应进行了评价。结果表明:斑马鱼3个生命阶段对亚硒酸钠的敏感性 (以96 h-LC₅₀ (致死中浓度) mg/L表示,其中mg指硒的质量) 顺序为:仔鱼(1.11 mg/L) >胚胎(1.48 mg/L) >成鱼(13.05 mg/L);对硒代蛋氨酸的敏感性:仔鱼(0.80 mg/L) >胚胎(1.03 mg/L) >成鱼(9.36 mg/L);对纳米硒的敏感性:成鱼(0.48 mg/L) >仔鱼(1.67 mg/L) >胚胎(4.32 mg/L)。除MTI法计算嘧菌酯与硒代蛋氨酸对成鱼表现为部分相加作用外,采用AI法、TU法和MTI法计算嘧菌酯与亚硒酸钠、硒代蛋氨酸和纳米硒对斑马鱼成鱼、仔鱼和胚胎的联合作用结果一致,均表现为拮抗作用。     

低温胁迫诱导斑马鱼ZF4细胞ROS及MAPK相关蛋白表达的影响

为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧(reactive oxygen species,ROS)之间的关系,本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维ZF4细胞进行不同程度的低温胁迫(18℃和10℃),监测其在不同低温胁迫时间下(1 d、3 d和5 d)ROS的变化以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中蛋白的表达情况。结果显示:(1)DCFH-DA探针法表明在低温胁迫作用下,细胞内ROS含量增加。细胞内ROS上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到(1.23±0.04)倍(P0.05)和(2.31±0.08)倍(P0.05)。(2)Western Blot检测磷酸化的p38(p-p38)和磷酸化的JNK(p-JNK p54和p-JNK p46)的水平变化,结果显示低温胁迫可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3 d达到最高水平。(3)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示,无论在18℃还是10℃,其在第3天呈现高表达。本实验初步证实低温胁迫能够诱导斑马鱼细胞ROS的产生;通过对不同时间点的蛋白表达水平检测,发现p-JNK、p-p38和γH2A.X激活时间点与低温诱导ROS表达时间点相吻合。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定基础,其中低温下处理3 d可以作为一个检测各个蛋白变化的关键时间点。     

DEHP对斑马鱼仔鱼HPG和HPA轴相关功能基因表达的影响

为了探讨邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)对斑马鱼早期生命阶段下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)和下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)相关功能基因表达的影响,将斑马鱼的受精卵暴露于10、30和300μg/L DEHP溶液中,同时设置空白对照,96 h后,利用实时荧光定量PCR技术,测定斑马鱼仔鱼HPG和HPA轴上12个功能基因的表达。结果显示,与对照组相比,30μg/L DEHP处理组的Cyp19b、GnRH3、Era和ERβ基因表达量显著升高,GnRH2、Pomc、Mr、Mc2r、Crh、Gr和Crhbp基因在各DEHP处理组表达量显著降低,FSH-β和Crhbp基因表达量无显著变化。以上研究结果表明：DEHP对斑马鱼胚胎/仔鱼阶段的2个主要内分泌分子通路产生了显著影响,将会导致内分泌功能的改变,从而可能影响斑马鱼的后期生长发育。     

斑马鱼原肌球蛋白基因克隆表达及免疫学鉴定

克隆斑马鱼原肌球蛋白的基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行鉴定。提取斑马鱼总RNA,采用RT-PCR克隆斑马鱼原肌球蛋白的全长基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增斑马鱼原肌球蛋白基因的完整开放阅读框,连入载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中通过IPTG诱导得到重组斑马鱼原肌球蛋白。重组蛋白经Ni 2+亲和层析柱纯化后进行Western-blot检测。获得斑马鱼原肌球蛋白基因,Western-blot结果显示重组蛋白具有良好的免疫活性。本研究成功克隆并表达了斑马鱼原肌球蛋白基因,经免疫学鉴定发现其具有过敏原性。     

斑马鱼早期胚胎发育囊胚sphere时期的蛋白组学研究

斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎发育囊胚时期是胚胎发育过程的关键时期,利用i TRAQ蛋白质质谱分析技术,检测斑马鱼早期胚胎发育过程中囊胚sphere时期的蛋白质表达情况,并分析该时期表达的蛋白质的相应功能和参与调控的生物过程。以野生型斑马鱼发育至sphere时期即4 hpf的胚胎为样本,利用i TRAQ标记与LC-MS/MS串联质谱技术,结合数据库比对,对该时期表达的蛋白质进行定性和定量的鉴定分析。检测结果共鉴定到的总蛋白数为1 178个,利用生物信息学进行功能分析,发现这些蛋白广泛参与了细胞信号传递、细胞运动和细胞骨架构建、细胞增殖、细胞分化、物质合成与代谢等各项重要的生命活动过程。研究表明,利用i TRAQ标记的方法可以对4hpf时期的斑马鱼胚胎中的蛋白质进行有效的分离和鉴定,并初步建立了斑马鱼早期发育关键阶段sphere时期的蛋白质组表达图谱,以期为斑马鱼胚胎发育过程中蛋白质组学和调控机制的研究提供参考。