Construction of Recombinant Expression Plasmid pYELmleA of mleA Gene and Expression in Saccharomyces cerevisiae

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的功能酶。笔者进行酒酒球菌SD-2a的苹果酸-乳酸酶基因重组表达质粒的构建。利用来自重组质粒pLmleA的，mleA基因，以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件。以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体，构建了重组表达质粒pYELmleA，并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58。酵母转化子用含有亮氨酸、组氨酸和色氨酸的YNB平板筛选鉴定。SDS—PAGE检测表明获得的转化子表达了约60KD的目标蛋白。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中。获得的转化子在添加了L-苹果酸的培养基中培养4d；取培养液上清用HPLC检测L-苹果酸及L-乳酸含量，采用t检验进行差异显著性分析，结果表明mleA基因进行了功能性的表达，将L-苹果酸转化成L-乳酸，L-苹果酸和L-乳酸含量分别与对照差异极显著和显著，L-乳酸的生成量为1002—1106mg／L。苹果酸的相对降低率为19．16—22．34％。     

The transfer of a gene for glutinous endosperm to Oryza glaberrima Steud. From a japonica variety of O. sativa L.

Summary In common rice, Oryza sativa L. (n=12), the gene Am for non-glutinous is dominant over the gene am for glutinous. In African rice, O. glaberrima Steud. (n=12), no spontaneous glutinous strain has been found, but recently a glutinous strain of glaberrima was induced by EMS-treatment.The interspecific cytoplasm substitution line with sativa cytoplasm and glaberrima nucleus is male sterile. It has been confirmed that the complete restoration of pollen fertility in this male sterile line is attributed to a single dominant nuclear gene Rf _j.Trial to transfer gene am from sativa to glaberrima was commenced with backcrosses of the F₁ hybrid (glutinous sativa cv. Iwai-mochi × glaberrima ) to glaberrima type plants of the substitution line homozygous for Rf _j,using the latter as the pollen parent. At the B₁ step, highly fertile glaberrima type Am/am plants were obtained. Thereafter plants of this type were backcrossed to normal glaberrima as the recurrent pollen parent to complete the nuclear substitution. It was confirmed that the EMS-induced glutinous character of glaberrima was a monogenic recessive and that the same gene controls the expression of glutinous character in the different rice species, sativa and glaberrima.     

Prepro-orexin基因多样性与猪产仔数的相关性

为了研究Prepro-orexin基因多样性与繁殖性能的关系，确立其在分子标记育种中的应用价值。本研究采用PCR-RFLP法分析猪Prepro-orexin基因第62位多态性位点在二花脸、香猪、淮猪和姜曲海猪4个品种中的多样性，并分析其不同基因型对二花脸猪产仔数的影响。结果表明，二花脸和香猪分别检出三种基因型，姜曲海猪有两种基因型，而淮猪只有一种基因型。各等位基因频率和基因型频率在不同品种间存在显著差异；二花脸猪不同基因型群体间产仔数差异不显著，说明该基因多样性对产仔数的影响不显著     

风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析

以蓝色风信子完全露出蓝色的花蕾为材料,利用RT-PCR和RACE技术,获得风信子DFR基因的全长cDNA。该cDNA全长1252 bp ,开放阅读框为1098 bp ,编码366个氨基酸。 Blast搜索结果显示,风信子DFR基因核苷酸序列与其它植物已报道的DFR基因具有66 %～77 % 的相似性,氨基酸序列有62 %～73 %的相似性。聚类分析表明, 最先与风信子聚类合并的是鸢尾,其次与其它单子叶植物聚类,最后与双子叶植物聚类。     

海洋红酵母耐盐cDNA文库的构建与序列分析

利用消减杂交技术（SSH）构建了海洋红酵母耐盐cDNA文库,一共挑出270个克隆子,选取了25个克隆进行测序,经过Blast分析,初步认为有一个克隆是与耐盐相关的基因,2个属于未知基因,其余为核RNA。     

小麦GAPDH 基因克隆及序列分析

采用Trizol法提取高质量小麦总RNA,并运用RT-PCR方法克隆了小麦GAPDH （甘油醛三磷酸脱氢酶）基因的部分序列(EU022331),长度为604 bp,核苷酸序列比对结果表明,该序列与大麦(M36650)、玉米(AY109397)、番茄(BT012693)GAPDH核苷酸序列的同源性分别为95%、86%和84%。GAPDH基因的克隆为在禾谷类作物研究的应用提供了一个较好的对照基因。     

绿色荧光蛋白基因银耳表达载体构建及表达

以银耳芽孢为材料,由载体pEGFP、pCAMBIA1300经过Hind III和EcoRⅠ双酶切、连接、转化,重组质粒酶切验证,笔者成功构建了由双孢蘑菇gpd启动子调控EGFP基因的银耳真核表达载体,命名pCB-BEGFP。采用电击转化法将携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP转化到银耳芽孢。提取4个转化子基因组DNA,用EGFP基因特异引物 PCR扩增,电泳结果表明有与EGFP基因大小一致的特异带出现;荧光显微镜观察在再生培养基上的转化子可看到很强的绿光;其中一个转化子蛋白SDS-PAGE电泳,结果发现在大约27kD处有一明显的蛋白条带出现,与预期的蛋白分子量相近。以上结果证明EGFP基因转入银耳芽孢中,双孢蘑菇启动子可以调控外源基因的在银耳芽孢中正确表达。     

海洋红酵母耐盐cDNA文库的构建与序列分析

 利用消减杂交技术（SSH）构建了海洋红酵母耐盐cDNA文库,一共挑出270个克隆子,选取了25个克隆进行测序,经过Blast分析,初步认为有一个克隆是与耐盐相关的基因,2个属于未知基因,其余为核RNA。     

Prepro-orexin基因多样性与猪产仔数的相关性

为了研究Prepro-orexin基因多样性与繁殖性能的关系,确立其在分子标记育种中的应用价值。本研究采用PCR-RFLP法分析猪Prepro-orexin基因第62位多态性位点在二花脸、香猪、淮猪和姜曲海猪4个品种中的多样性,并分析其不同基因型对二花脸猪产仔数的影响。结果表明,二花脸和香猪分别检出三种基因型,姜曲海猪有两种基因型,而淮猪只有一种基因型。各等位基因频率和基因型频率在不同品种间存在显著差异;二花脸猪不同基因型群体间产仔数差异不显著,说明该基因多样性对产仔数的影响不显著     

苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白.基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害.通过DNA重组技术,从BtHZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明.cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%～99.91%.对应的氨基酸序列同源性为99.49%～99.74%.对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质.结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关.该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源.