云南地方水稻品种抗稻瘟病基因Pita功能区段序列变异分析

稻瘟病抗性基因序列变异的分析与认识是挖掘水稻抗稻瘟病基因资源的基础。对来源于云南省56个县(市)的218份地方稻品种稻瘟病抗性基因Pita第二编码区功能位点区段的609个碱基进行了测序分析。结果表明,所有供试品种在此序列上有18个变异位点,存在46种DNA单倍型和28种蛋白类型,其中DNA单倍型Pita-H1、Pita-H2、Pita-H6频率较高,三者比例分别为17.89%、29.82%、20.18%,合计67.89%,是云南的优势单倍型,而其他单倍型频率较低,频率0.46%~3.67%。携带Pita抗性基因(编码区第2752位功能位点碱基为G)的品种共61个,占供试材料的27.98%,其中39个品种(占63.93%)与越南抗性品种Tetep序列一致。Pita抗性基因在水稻各亚种和生态型中的分布是不平衡的,籼稻中的频率为35.06%,粳稻中为24.11%,水稻中31.03%,陆稻中21.92%,黏稻中30.77%,糯稻中18.37%。Pita抗性基因在云南省广泛分布,36县(市)检测到了Pita抗性基因,但南部地区频率高于其他地区,且有的县频率较高,呈小集中的特点,海拔2200m以上的7个品种未能检测到Pita抗性基因。     

分子标记辅助选育抗稻瘟病水稻新品种‘铁粳16’

稻瘟病是对水稻生产威胁最大的真菌病害,选育抗病水稻品种是防控该病最经济有效的途径。研究表明,聚合多个抗病基因可提高品种的抗性、拓宽抗谱。本研究以携带抗稻瘟病基因Pib的‘辽粳9234’和携带抗稻瘟病基因Pita的‘铁粳7号’为亲本,利用常规育种技术与分子标记辅助育种技术相结合从后代中鉴定到聚合抗稻瘟病基因Pita和Pib的后代。通过连续3年生产试验和米质分析,鉴定到1个同时具有抗稻瘟病基因Pita和Pib的稳定株系A-3,通过辽宁省水稻品种审定,命名为‘铁粳16’。人工接种结果表明‘铁粳16’较其亲本抗谱宽、抗性强。研究结果证实聚合Pita和Pib可提高水稻品种对稻瘟病的抗性,可为抗病基因聚合育种提供参考。     

稻瘟病抗性基因Pita在中日韩粳稻中的分布

为了解2 350份来源中国、日本和韩国粳稻品种(系)稻瘟病抗性基因Pita的分布,利用2个KASP分子标记对该基因进行了检测,605份材料表现有利,1 732份不利,7份为杂合,6份不确定。在有利、不利和杂合三个群体中分别随机选取316份、101份和7份材料,对Pita基因功能片段进行了测序分析,结果显示有利群体中KASP检测结果准确率为95.89%,不利群体100%,2个KASP分子标记可以用来联合检测水稻种质资源的Pita抗性基因。根据KASP分子标记检测结果,在中国北方地方稻种中仅0.69%品种携带Pita抗性基因,在中国13个省区市育成品种(系)和日本韩国外来稻种中均有一定的分布,频率7.02%~55.81%,表明Pita基因在东亚地区范围内均得到了一定的应用,但各地区应用程度相差较大,其中中国吉林、辽宁、宁夏、浙江四省地区较高。通过415份材料Pita基因功能片段609个碱基序列的比较,仅发现3个变异位点(第2 388位,第2 752位,第2 766位)和4种基因单倍型,其中抗性基因仅一种单倍型(H1),感病基因有三种单倍型(H2, H3, H4),H2为优势单倍型(84.84%)。本研究结果为开发和利用中日韩地区稻种资源和品种布局提供了依据。     

利用CRISPR/Cas9系统定向改良水稻稻瘟病抗性

[目的]CRISPR/Cas9 基因编辑技术是作物遗传改良的有效工具。本研究通过对水稻Pita、Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑,以期获得能够稳定遗传的抗稻瘟病水稻材料。[方法]利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术,以 Pita、Pi21 和 ERF922 为靶基因,构建共编辑载体 pC1300-2×35S::Cas9-g^Pita-g^Pi21-g^ERF922 ,用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014,筛选获得稳定遗传的纯合突变体用于稻瘟病抗性鉴定。[结果]在T0代转基因株系中,Pita、Pi21和ERF922 突变频率分别为 75%、85%和 65%,突变基因型多为双等位突变。筛选到的不含 T-DNA成分的T1代能够稳定遗传给T2代,并从中获得 Pi21单突变纯合株系及Pita、Pi21和ERF922的三突变纯合株系。稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变株系的抗性显著提高。同时,接种后纯合突变体株系内水杨酸、茉莉酸和乙烯等信号转导途径相关基因的表达量均上调。据此,我们推测纯合突变株系对稻瘟病的抗性增强可能与其对稻瘟病菌的响应被激活有关。[结论]利用 CRISPR/Cas9 技术获得了能够稳定遗传和具有较高稻瘟病抗性的纯合突变株系,为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。     

稻瘟病抗性基因 Pi2、Pita 的特异 KASP 标记开发与应用

【目的】水稻稻瘟病抗性基因 Pi2 和 Pita 是对华南稻区稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因,对水 稻的稻瘟病抗性育种具有重要应用价值,开发一套高效的鉴定方法有利于提高水稻抗病品种培育效率。【方法】 根据高抗稻瘟病品种‘黄广油占’与高感稻瘟病品种‘广陆矮 4 号’在 Pi2 基因的第 787 位、第 788 位密码子上的 变异 GCA GGA/GTG TTA,以及高抗稻瘟病国际稻种质资源 Tetep 与高感稻瘟病地方种质资源丽江新团黑谷在 Pita 基因第 6 640 位碱基上的变异 G/T,基于竞争性等位基因 PCR（Kompetitive Allele Specific PCR,KASP）标记技术原 理,开发抗稻瘟病基因的分子标记。【结果】开发了两个抗稻瘟病基因 Pi2 和 Pita 的功能位点 KASP 标记（W-Pi2、 W-Pita）,利用标记对广东省农业科学院水稻研究所培育的常规稻、香稻、杂交稻新品种进行检测,筛选出抗性品 种 19 个,其中单个基因检测为抗病等位基因型的水稻品种有 13 个,两个基因均为抗病等位基因型的品种有 6 个, 比较两个标记结果,Pi2 抗性等位基因在育成品种中的频率高于 Pita 抗性等位基因频率。综合所有结果,表明 2 个 标记可在早期（种子或苗期）检测育种材料抗稻瘟病基因 Pi2 和 Pita 的等位基因型,无需将育种材料种植到病圃鉴 定即可筛选出抗病单株。【结论】利用开发的 KASP 功能分子标记 W-Pi2、W-Pita 能够较好区分不同抗性的水稻 亲本品种,可清楚区分水稻育种材料间不同的等位基因型,对育种材料进行准确筛选。     

利用HRM功能标记检测黑龙江省水稻抗稻瘟病基因Pita和pik的基因型分布

为明确Pita及pik基因在黑龙江省水稻种质资源中的分布情况,本研究以67份黑龙江省主栽品种及优异种质资源作为试验材料,通过HRM技术,利用Pita及pik的HRM功能型分子标记Pita-G/T、Pik2-C/T,对67份材料进行基因分型。结果表明,67份种质中,含纯合Pita有27份,占参试种质的40.3%;纯合pik有22份,占参试种质的32.9%,同时含有两基因的为12份,比例为17.9%。综上,Pita-G/T及Pik2-C/T 标记可以高效准确地对黑龙江水稻资源进行基因分型,同时,通过基因分型,明确了Pita及pik在黑龙江省的分布情况,为抗稻瘟病育种提供了理论基础。     

一种高效便捷的水稻DNA提取法及其应用

 以水稻叶片、根和种子为材料,采用高通量快速法提取基因组DNA,用稻瘟病Pita基因分子标记进行检测,获得与预期片段大小一致的特异性条带,对165份育种材料的检测结果与稻瘟病接种鉴定一致。操作方法如下：将少量水稻叶片、根或种子放入 200 μL PCR盘中,加入70 μL 缓冲液A (含NaOH和Tween20),在PCR仪中加热到95℃,保持 10 min,再加入70 μL 缓冲液B (Tris HCl和EDTA),该提取液可以直接用于PCR扩增。该方法具有几个优点：1）成本低,仅用4种化学试剂,共140 μL 提取液;2）操作简便,仅需3步,每人每天可以提取上千份样品;3）仪器设备简单,只用常规的PCR仪;4）可直接提取干种子的DNA;5）DNA质量好,能检测出水稻中的抗稻瘟病单基因Pita,并且与稻瘟病接种鉴定结果一致;6）用量少,只需要 5~20 mg 叶片、20 mg 根或半粒籽粒。尤其是检测大量样本的基因型时, 此种方法更显得高效便捷。     

稻瘟病抗性基因Pita~2候选基因多位点编辑载体的构建

Pita2是定位于水稻第12号染色体着丝粒区域的稻瘟病广谱抗性基因,前期研究中通过精细定位得到了5个候选基因,其功能及作用原理还不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建Pita2候选基因的多位点编辑载体。首先在候选基因外显子区域找到2个含有PAM序列的特异性靶位点序列,并构建候选基因入门载体SK-gRNA,然后利用同尾酶将SK-gRNA重组载体上的目的片段gRNA酶切,采用一步法将2个gRNA连接到双元表达载体p C1300-Cas9。质粒PCR鉴定以及测序的结果表明,以上5个多位点编辑载体构建成功。后期通过遗传转化并鉴定候选基因表达量与抗病性之间的关系,为水稻稻瘟病抗性基因Pita2功能研究奠定基础。     

分子标记辅助选育聚合抗稻瘟病基因Pi5及Pita的水稻新品系

稻瘟病是对水稻生产具有严重威胁的真菌病害,选育并推广聚合多个抗稻瘟病基因的抗病品种是防控该病最为经济有效的途径.本研究以携带不同抗稻瘟病基因的'吉粳105'(Pita)和'T639'(Pi5)为亲本杂交衍生的后代群体为试材,利用分子标记辅助育种技术,筛选到3个聚合抗稻瘟病基因Pita.和Pi5的后代.并以其中一个株系'...     

江苏水稻品种稻瘟病主效抗性基因鉴定及应用评价

以28个抗稻瘟病单基因系和740个水稻品种为材料,在江苏省连云港市的水稻种植区进行稻瘟病抗性的田间鉴定。结果表明,28个单基因系中藤板5号(Pii)、砦1号(Pizt)、F-80-1(Pik)、F-124-1(Pita)、F-98-1(Pikm)、F-128-1(Pita2)、C101LACC[Pi1(t)]、C101A51[Pi2(t)]和C104PKT[Pi3(t)]等表现较高的抗性,供试材料中高抗、抗、中抗、中感、感和高感的品种数分别是97、230、200、93、48和55个。从中选出Pii、Pikh、Pi1、Pi2、Pita、Pik、Pikm、Pikp和Pib,并增加了广谱高抗基因Pi9,对其中的195个高抗、高感和重要品种进行抗性基因功能标记分析,结果表明,含有Pii、Pikh、Pita、Pib、Pi2和Pik的品种数分别有28、40、52、110、11和2个,未检测到含有Pi1、Pikm、Pikp和Pi9的品种。除Pib外,其他3个检测到的基因基本都存在于抗性或高抗品种中。