菠菜胆碱单氧化酶(CMO)基因的克隆及在大肠杆菌中的诱导表达

甘氨酸甜菜碱是一种非毒性的渗透调节物质 ,在植物体内是以胆碱为底物 ,经两步氧化而合成的 .菠菜中 ,催化第一步反应的酶为胆碱单氧化酶 (CholineMonooxygenase ,CMO) .为了研究胆碱单氧化酶基因的功能以及转基因植物的抗逆能力 ,在 30 0mmol L高盐浓度 (n(NaCl)∶n(CaCl2 ) =5 7∶1)的条件下 ,作者分离纯化了菠菜mRNA ,经RT PCR得到全长 (1.3kb)胆碱单氧化酶 (CMO)cDNA ,与已经报道的基因序列相比较 ,同源性为 99% .根据其核苷酸序列推导得到了氨基酸序列 .将PCR纯化产物与pET 30a+ 连接 ,构建了重组表达载体pETCMO ,并转化到大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导获得高效表达 .     

甜菜碱合成酶基因转化羊草的研究

以吉生1号羊草根茎为外植体诱导愈伤组织,通过基因枪法分别将甜菜碱合成酶基因CMO、BADH以及CMO)+BADH双价基因导人羊草中,用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到了抗盐碱转化植株.对转化植株进行PCR扩增后电泳检测及Southern杂交,初步证明目的基因序列已经整合到羊草基因组中.在混盐高pH值胁迫下,羊草叶片甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照.     

农杆菌介导的 BADH—CMO 基因转化玉米愈伤组织的初步研究

植物的耐盐性是一个多基因控制的复杂性状,将多个耐盐相关基因导入同一植物更有助于提高植物的耐盐能力.以玉米自交系H99、丹988的胚性愈伤组织为受体材料,通过愈伤组织对NaCl的敏感性试验,确定转化愈伤组织的适宜选择压,适宜愈伤组织转化的盐浓度为225 mmol/L.并对农杆菌遗传转化系统的条件进行了初步研究,用带有pCAMBIA-1301-CMO-BADH质粒的根癌农杆菌转化玉米愈伤组织,结果表明:采用EHA105的菌株振荡20h后,菌液OD值为0.5～0.6时侵染25 min为农杆菌转化的适宜条件.对移栽成活的36棵抗盐植株经PCR检测有2株呈阳性,阳性株率最高达到5.6％,初步证明目的基因已整合到玉米基因组中.     

梭梭胆碱单氧化物酶基因(CMO)的cDNA克隆

甜菜碱被认为是在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质,广泛存在于植物、动物细胞中,高等植物中的甜菜碱生物合成是以胆碱为底物催化合成,即:胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱,其中第一步是甜菜碱合成的限速反应,由胆碱单氧化物酶(CMO)催化.以梭梭为材料,提取总RNA,用RT-PCR法合成梭梭CMO的cDNA,约为821 bp,测序结果表明,该克隆包含一个完整的开放读码框,编码一个由262个氨基酸构成的多肽,通过BLAST进行同源性比较,发现此基因与菠菜和山菠菜中同源基因CMO的同源性为75%和82%,证明此基因为梭梭的CMO同源基因.     

农杆菌介导的辽宁碱蓬胆碱单氧化酶基因CMO转化烟草提高抗氧化胁迫的研究

通过农杆菌介导的遗传转化,将来自辽宁碱蓬的甜菜碱合成关键基因－胆碱单氧化酶基因CMO 转入烟草,以提高烟草耐受氧化胁迫的能力,并对得到抗生素抗性植株进行了分子检测和百草枯诱导 的氧化胁迫。Southern 和Northern 检测表明CMO 已经整合到烟草基因组中,并得到了正确的表达,但 不同转基因株系中的拷贝数不同,株系T1、T2、T6 为单拷贝;株系T4、T5 为双拷贝;株系T3 为3 个拷 贝。在10 μM 和20 μM百草枯胁迫24 h 的情况下,转基因植株表现了较强的耐受氧化胁迫能力,各转 基因株系和野生型相比具有较低的丙二醛含量和较高的超氧化物歧化酶活性。这可能是转基因植物 中甜菜碱的积累诱导或保护了抗氧化酶的活性,使得转基因植株受到的氧化胁迫较低,转基因植株中 较低的电导率也证明了这一点。转CMO 基因烟草耐氧化胁迫能力的提高,说明CMO 基因可以进一步 在玉米、水稻等重要农作物中应用以提高其耐受干旱、低温等非生物胁迫的能力。     

植物甘氨酸甜菜碱与耐盐性

非生物胁迫尤其是水盐胁迫一直是影响农业生产的关键因素,培育耐盐耐寒新品种也一直是生物育种的研究方向,甜菜碱作为一种小分子的非毒性渗透调节剂,是植物响应非生物胁迫的重要物质。综述了甘氨酸甜菜碱合成途径中的胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶这两种关键酶的分子生物学特性及其基因工程的最新研究进展。     

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭(Haloxylon ammodendron)中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPT Ⅱ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种“优引三号”,对所获得的转基因植株进行PCR检验。【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。     

茶树胆碱单加氧酶CsCMO的克隆及甜菜碱合成关键基因的表达分析

【目的】从茶树中克隆甜菜碱（GB）合成途径中的关键酶——胆碱单加氧酶CsCMO,研究不同逆境胁迫和不同抗寒茶树品种间GB合成中关键基因的表达模式,并分析茶树体内GB的含量,为茶树抗性育种奠定基础。【方法】采用反转录PCR结合RACE技术,从茶树中克隆CsCMO的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析,结合前期克隆得到的茶树甜菜碱醛脱氢酶CsBADH,用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法分析这2个基因的表达模式,紫外分光光度计测定GB含量。【结果】克隆得到茶树CsCMO（GenBank登录号：JX050146）的cDNA全长1 558 bp,包含1 305 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码434个氨基酸,并被定位在叶绿体上。氨基酸序列分析表明,CsCMO含有CMO中保守的Rieske型2Fe-2S结构域和单分子非血红素Fe结合位点,与其它植物CMO序列相似性在50%以上;进化树分析显示,它与枸杞的关系最近。qRT-PCR分析表明,4℃低温、NaCl盐和ABA处理均能诱导CsCMO和CsBADH表达,96 h内随着处理时间的增加,表达量呈增加趋势,但2个基因的表达模式有差异,盐胁迫诱导基因表达更显著;在不同抗寒品种中,2个基因的表达在抗性强的品种中表达量总体要高于抗性弱的品种,且CsBADH的变化比CsCMO的显著。3种胁迫处理48 h后,叶片中的GB含量均增加;低温处理后抗寒性强的品种中GB含量比抗寒性弱的高。【结论】克隆了茶树CsCMO,在低温、NaCl盐以及ABA处理下,GB积累,CsBADH和CsCMO上调表达,且盐胁迫下的表达更明显,表明GB与茶树抵御这3种胁迫关系密切。     

柴达木盆地梭梭CMO基因的克隆及其蛋白结构预测

对柴达木盆地梭梭的CMO基因进行扩增,并利用生物软件对CMO基因序列进行分析、对蛋白结构进行预测。结果表明,柴达木盆地梭梭CMO基因长度为1 341 bp,编码447个氨基酸。CMO蛋白亲水性、二级结构、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋区、三级结构预测结果显示柴达木盆地梭梭CMO蛋白亚细胞定位于叶绿体,无信号肽,蛋白二级结构主要为无规则卷曲。CMO蛋白具有多个多种类型的功能位点,为蛋白功能的实现提供了保障。此外CMO蛋白的亲水性较强,无跨膜螺旋区。柴达木盆地梭梭CMO蛋白三维结构预测结果显示CMO蛋白三维结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲互相盘绕而成。     

草地早熟禾转CMO-BADH双基因和转CMO基因耐盐性分析

通过对非转基因草地早熟禾(Poa pratensis L.)、转CMO-BADH双基因草地早熟禾、转CMO基因草地早熟禾进行不同浓度的NaCl胁迫试验,测定其细胞膜的透性,丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、氧化氢酶(CAT)活性,评定各株系耐盐能力的强弱,同时还验证并比较了CMO-BADH双基因和CMO基因的耐盐性功能,为耐盐新品种的选育提供了理论依据。结果表明:所有株系的相对电导率、MDA含量均随盐浓度增加而增大,在NaCl胁迫下相对电导率和MDA含量的大小顺序为:非转基因株系>转CMO基因株系>转CMO-BADH双基因株系;在NaCl的胁迫下,各个株系的SOD活性、POD活性、CAT活性都有明显的提高,此3种指标的大小顺序为:转CMO-BADH双基因株系>转CMO基因株系>非转基因株系;综合考虑各个指标,各株系耐盐性强弱顺序为:转CMO-BADH双基因株系>转CMO基因株系>非转基因株系。