芥菜开花相关基因AGL24的表达及与SOC1、SVP和FLC蛋白的互作

为阐明芥菜（Brassica juncea Coss.）开花激活因子AGL24的表达特性及其在开花途径中与调节因子SOC1、SVP和FLC蛋白的互作机制,从‘青叶芥’中克隆了680 bp的AGL24基因,它编码221个氨基酸。序列分析表明：芥菜AGL24含有M、I、K和C域,分别有59、11、102和47个氨基酸,与油菜AGL24亲缘关系较近。荧光定量PCR分析发现：在低温春化途径和长日照光周期途径中,AGL24在叶片和茎尖中均有表达,营养生长期表达量较低,而生殖生长期表达量迅速增加;AGL24在光周期途径中的表达峰值要早于低温春化途径。酵母双杂交试验表明：全长AGL24与开花信号整合子SOC1蛋白能够互作,激活酵母报告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1,在QDO/X-α-Gal/AbA平板培养基上长出蓝斑。另外,分别去掉M域后的截短体AGL24与SOC1也能相互作用。β–半乳糖苷酶活性检测发现：截短体杂交组合AGL24 × SOC1的互作强度显著高于全长杂交组合AGL24 × SOC1。然而全长AGL24或截短体AGL24 均不能与光周期途径核心抑制子SVP互作,也不与低温春化途径核心抑制因子FLC相互作用,说明AGL24并不是SVP或FLC的直接靶蛋白。     

芥菜开花整合子SOC1与AGL24蛋白K结构域的互作位点鉴定

芥菜开花整合子SOC1与AGL24相互作用能够调节开花时间。为了深入研究SOC1与AGL24蛋白互作的分子机理,利用ISIS系统在线预测了SOC1/AGL24互作位点,并分别在MIKC型蛋白SOC1和AGL24的K域构建了5个SOC1突变体和3个AGL24突变体。酵母双杂交和β–半乳糖苷酶活性检测表明：突变体AGL24R137L和AGL24E169L能够与SOC1蛋白互作,但作用强度与SOC1/AGL24差异不显著;然而AGL24蛋白第107位的谷氨酰胺突变为亮氨酸后（AGL24Q107L）,则与SOC1的作用消失。说明SOC1/AGL24的作用强度能够被AGL24蛋白K域第107位调节,但可能不受第137和169位调控。进一步研究发现：SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、SOC1R109L和SOC1C137K突变体均能与AGL24相互作用;但SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V和SOC1R109L突变体与AGL24的作用强度均显著低于SOC1/AGL24,而SOC1C137K突变体与AGL24的作用显著高于SOC1/AGL24。说明SOC1/AGL24的作用强度能够被SOC1蛋白K域第77、81、108、109位负调控或者第137位正调控。这为利用氨基酸位点调节SOC1/AGL24的深入研究及其开花时间分子调控奠定了基础。     

甘蓝开花抑制因子FLC 家族氨基酸序列差异及其对FLC/SVP 聚合化的影响

 为深入研究甘蓝Flowering Locus C（FLC）家族与SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）蛋 白互作的分子机理及其对开花的调控作用，从甘蓝‘ZQ-67’材料中克隆了5 个FLC 家族基因（记为 BoFLCy1 ~ BoFLCy5）。它们均编码MIKC 型蛋白，按进化关系其编码蛋白可分为两类：BoFLCy3 和BoFLCy5 为第Ⅰ类，仅在C 域有1 个位点变异；BoFLCy1、BoFLCy2 和BoFLCy4 为第Ⅱ类，仅在K、C 域分别有1、 2 个位点变异。酵母双杂交显示：甘蓝BoFLC 家族蛋白均可与BoSVP 蛋白互作；但BoFLCy4 蛋白最为敏 感，其N 端插入3 个氨基酸TET 会破坏该作用。β–半乳糖苷酶活性分析表明：BoFLCy1 ~ BoFLCy5 与 BoSVP 互作强度差异显著，强弱关系为：BoFLCy1 > BoFLCy2 > BoFLCy3 > BoFLCy5 > BoFLCy4，该家族蛋 白KC 域内的变异位点若为疏水氨基酸则有利于FLC/SVP 聚合。进一步分析突变BoFLCy4 蛋白IK 域内 的保守位点发现：蛋白作用强度可能不受I 域的这些保守性亲（疏）水氨基酸（第63、77 位）影响，而 会受到K 域保守氨基酸（第120、121、135、157 位）的亲（疏）水性调节。