猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

参照Genbank上公开发表的PCV1全基因序列设计引物,以质粒pSK-PCV为模板扩增出PCV1-ORF2基因,插入pMD18-T载体,对筛选出的阳性质粒进行测序,将测序结果同Genbank上发表的PCV1基因序列相比较,同源性达97％,再与Genbank上发表的PCV2的ORF2基因序列相比较发现PCV1-ORF2和PCV2-ORF2的差异表现在两者在核苷酸序列的2个部位互相存在基因缺失现象。将推导出的PCV1-ORF2的氨基酸序列同PCV2-ORF2进行比较,发现二者在几个功能区相当保守,尤其是N-末端的核定位序列、N-糖基化位点以及酪氨酸磷酸化位点。     

抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用本室构建的质粒PGEX-ORF2特化BL21（DE3）．经IPTG诱导表达．得到PCV2-ORF2的重组蛋白，经复性纯化后作为免疫原．采取常规免疫与体外脾脏免疫结合的方式免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与Sp2／0的骨髓瘤细胞融合．经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，获得了2株抗PCV2-ORF2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞．分别命名为382F4和9C3132，其细胞培养上清效价分别为1：1024、1：512，小鼠暖水效价分别为1：204800、1：102400。ELISA结果显示，382F4和9C3D2仅与融合表达的PCV2-ORF2蛋白反应，而与PGEX-KG表达的蛋白、猪细小病毒（PPV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不反应．说明此2株单抗特异性好。间接免疫荧光结果显示．382F4和9C3D2能与PCV2发生反应，而不与PCV1发生交叉反应．表明所获得的2株单抗是PCV2型特异性的。这2株单抗的获得为进一步研究PCV2-ORF2基因的功能．及建立准确快速的鉴别PCV1和PCV2的诊断方法提供了强有力的手段。     

抗胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的单克隆抗体的制备

分别用大肠杆菌(Escherichia coli)表达的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆与筛选,分别获得能稳定分泌ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的杂交瘤2株(4、16)、3株(14、3Fll、16G10)和2株(44、53).这7株杂交瘤细胞的染色体数分别为87(81～94)、84(81～88)、90(85～94)、87(80～94)、82(79～85)、93(88～99)和85(82～87),其腹水ELISA效价分别为100×210、100×29、100×210、100×27、100×214、100×214和100×212.间接ELISA和Westernblot分析结果证明,所有单克隆抗体均具有与相应天然毒素的反应活性,且特异性良好.     

猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。     

伪狂犬病病毒Ra株体外感染ST细胞超微结构的研究

本研究以伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)Ra株体外感染ST细胞为生物模型,通过透射电镜对PRV的增殖规律和致细胞病变的显微结构进行观察。结果显示,PRV能诱导ST细胞发生明显病变,细胞的病变程度与PRV感染时间密切相关。PRV Ra株感染ST细胞,病毒吸附于ST细胞表面,以膜融合内陷的方式进入细胞和细胞核内,在细胞核内复制,出现包涵体结构,以出芽方式离开细胞核,在高尔基体等细胞内膜结构处完成病毒粒子的囊膜化过程。感染前期,病毒通过膜融合方式被释放到细胞外,完成细胞间病毒的传播;感染后期,细胞溶解,大量释放病毒粒子。感染细胞超微结构的变化主要体现为:线粒体肿胀、数目减少,嵴面积减少,核内出现包涵体,细胞融合,细胞内空泡化严重,溶细胞现象。     

猪圆环病毒2型疫苗研究进展

猪圆环病毒2型(PCV-2)感染是一种新发现的猪传染病,以5周龄～12周龄仔猪高发病率、高死亡率及导致机体淋巴系统损伤与免疫缺陷为主要特征。PCV-2感染在世界各养猪国家广泛流行,给各国养猪业造成了巨大的经济损失。PCV-2疫苗研究已成为国内外学者的研究焦点。迄今为止,西欧与美国已有PCV-2疫苗注册上市,主要为灭活疫苗与亚单位疫苗。由于灭活疫苗与亚单位疫苗成本高,且注射次数多,容易造成机体应激,因此,弱毒疫苗、活载体疫苗及核酸疫苗等新型疫苗是目前研究的重点,并取得了长足的进展。论文主要概述了PCV-2疫苗研究的最新进展,以期为PCV-2疫苗研究提供一定的参考资料。     

伪狂犬病毒感染ST细胞的增殖抑制及对细胞周期的影响

以猪伪狂犬病毒(PRV)容A株感染体外培养的ST细胞为模型,采用体外细胞培养技术、噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞计数检测梯度剂量的PRV病毒感染ST细胞株过程中细胞的增殖抑制及对细胞周期的影响.结果显示,PRV感染前期(8h和16h)促进ST细胞的增殖,24h以后可显著抑制细胞增殖,这种抑制与时间密切相关,与感染剂量无显著相关.PRV感染ST细胞可显著地改变细胞周期各时相分布,24 h时细胞G1、S期所占比例明显升高,48 h细胞停滞在G2期,出现明显的凋亡峰.结果表明,PRV在感染过程中对细胞生长的影响与时间紧密联系,最终可显著使细胞停滞在G2期,诱发细胞调亡.     

抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病病毒 (PRV) g G蛋白作为抗原 ,免疫 BAL B/c小鼠 ,经细胞融合、克隆后 ,获得了1F6、2 B92株稳定分泌抗伪狂犬病病毒 g G蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。 1F6、2 B9培养上清及小鼠腹水效价(EL ISA)分别为 1∶ 2 1 1 、1∶ 2 1 1 及 1∶ 10 0× 2 1 1 、1∶ 10 0× 2 1 2 。 1F6、2 B9的染色体众数分别为 87(80～ 94 )、84 (81～ 87)。经间接 EL ISA鉴定 ,1F6、2 B9单抗分别属于 Ig G2 a、Ig G3亚类。1F6、2 B9与猪伪狂犬病病毒 Ea株感染细胞的间接免疫荧光试验结果表明 ,1F6、2 B9确实为伪狂犬病病毒 g G蛋白的单抗。所得单抗与牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV)、猪细小病毒 (PPV)、猪繁殖与呼吸道综合征病毒 (PRRSV)之间无交叉反应     

H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

以禽流感病毒A/Chicken/Hubei/327/2004(H5N1)免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,1E12,2E11,4C12,4G2和5E12。细胞培养上清HI效价为24~27,腹水HI效价可达210~218。所有单抗与禽流感H7和H9亚型标准血凝抗原,新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒无交叉反应。在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测中发挥重要作用。