大熊猫犬冠状病毒的分离与鉴定

以犬肾传代细胞(MDCK)从1只病死大熊猫肝脏中分离到1株病毒,命名为DXMV。电镜观察磷钨酸负染的病毒细胞培养物，发现冠状病毒样粒子，超薄切片上可见细胞浆内病毒包涵体。理化学和生物学鉴定结果表明，DXMV核酸类型为RNA，对氯仿、乙醚敏感，可耐受1％胰蛋白酶的作用，具有一定的耐酸性和耐热性，可在MDCK、FCWF、F81细胞中增殖，无血凝性和血吸附特性。血清中和试验结果表明，DXMV可被犬冠状病毒阳性血清中和。采用犬冠状病毒间接荧光抗体法染色DXMV细胞飞片，可在细胞浆内见到特异性荧光。以冠状病毒通用引物和犬冠状病毒特异性引物，可从大熊猫肝脏和不同代次的病毒细胞培养物中扩增出与预期值251bp和515bp大小相同的核苷酸片段。由此说明，该病毒为犬冠状病毒，大熊猫可被犬冠状病毒感染。     

大熊猫犬冠状病毒部分S基因的克隆与全S基因序列分析

从重庆某动物园死亡的大熊猫肝脏中分离到一株病毒，经鉴定为犬冠状病毒（命名为CCV DXMV）。本实验根据CCV K378和CCV Insavc-1株基因序列设计合成了普通PCR引物SF1-SR1和SF2-SR2，以及半套式引物SF3-SR3、SR13、SF13、SF4-SR4和SF14，分段扩增了CCVDXMV株部分S基因，得到了368bp、792bp、737bp、1178bp和985bp5个基因片段。将纯化的RCR产物分别克隆到pGEM—T载体中，通过筛选和鉴定，获得了5个阳性重组质粒。将重组质粒送生物公司测序，将测得的基因序列与先前测定的该株病毒部分S基因序列，拼接成全S基因序列，并与其它株CCV及TGEV HN2002和FIPV79—1146株的S基因序列进行分析比较，绘制进化树。结果表明，该株病毒与CCV K378株的同源性最高，达到99．4％；而与CCV 23／03株的同源性最低，为56．9％；与FIPV和TGEV分别有90．4％和82．1％的同源性。     

银中杨生长特性的研究

通过对银中杨生长特性研究表明 ,银中杨在生长方面超过当地推广树种小黑杨 ,其中材积生长超过小黑杨 73.4 %～ 2 6 9.2 % ;在本地区生长超过目前东北、内蒙及华北地区的优良杨树品种。探讨了银中杨生长规律及适宜栽植密度 ,并对银中杨生长划分 5个时期 ,为合理经营银中杨提供科学依据。     

荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的构建及表达

为了构建荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链原核表达载体,并获得SLA-3-HB01表达蛋白,试验以SLA-3-HB01/pMD18-T为模板进行PCR扩增四聚体前体链SLA-3-HB01-BSP,并克隆至pMD19-T载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆并测序,目的基因连接至表达载体pET-21a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况,提取包涵体并进行检测。结果显示,PCR成功扩增得到SLA-3-HB01-BSP,大小为896bp左右。酶切鉴定证实,目的基因成功克隆至pMD19-T载体中,插入片段大小为876bp,阳性克隆经测序后所获序列与原序列一致,并在3′端带有BSP标签序列。酶切鉴定进一步证实成功构建SLA-3-HB01-BSP/pET-21a(+)重组表达载体,经转化及诱导表达,SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子质量在33.5ku左右。包涵体蛋白分子质量约33.5ku,与菌体中目的蛋白大小一致,经凝胶成像系统UVP扫描分析,包涵体蛋白纯度接近于90%,符合进行相关结构和功能研究的要求。本研究成功构建了荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的pET-21a(+)重组表达系统,并获得了一定纯度的包涵体蛋白。     

鸭MHC I 轻链 cDNA克隆及其蛋白的二级结构

为了阐明鸭主要组织相容性复合体 I 结构并推进其功能研究，本文采用Full RACE PCR法从其淋巴细胞cDNA文库中克隆了鸭MHC I 轻链 (b2m) cDNA. 随后，在pMAL-p2Ｘ/E.coli TB1原核表达系中可溶性表达了其成熟肽蛋白基因，并进行了纯化、蛋白酶切和Western Blot鉴定. 最后，测定了融合蛋白和MBP单体的圆二色谱(CD)值. 鸭b2m cDNA长792 bp，包含18 bp 5’端和414bp 3’端非翻译区. 其ORF为119个氨基酸 (aa)，包含20个aa信号肽和99 aa成熟肽。成熟肽序列的第25位和80位为半胱氨酸(C)，第80位半胱氨酸附近序列为“YTCRVDH”，与免疫球蛋白超基因家族的特征基序 “F/YCXV/AXH”相符.氨基酸序列与鸡、鱼、蛙、人和鼠β2m比较，同源性在30.3%-65.9%之间. CD测定结果表明鸭b2m α螺旋、β折叠、转角、随机卷曲分别为0 aa、50 aa、23 aa 和26 aa，呈典型的β折叠。同源模建也显示鸭b2m 三级结构(3D)由7个β片层折叠而成，不含α螺旋，这与CD测定结果相符合，并与人和小鼠b2m 3D结构相似.     

我国一杂交商品猪IgM恒定区CH3-CH4亚区的克隆与表达

目前，国内对猪免疫球蛋白方面的研究较少，赵凯等于1999年对猪IgGH链进行了克隆和表达一。BOSCH等克隆了猪的IgM链，但至今未有关于猪IgM功能区蛋白表达方面的研究报道。本文将对我国一商品杂交品种皮杜猪的IgMCH3-CH4区进行了PCR扩增、克隆、序列测定和分析，并通过表达载体进行表达。其目的是为以后进一步研究IgM抗体亚区的功能打下基础。     

表位疫苗研究进展

表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗,相对传统疫苗,拥有较多优势。表位疫苗设计的关键是筛选表位,表位的筛选包括蛋白质降解法、肽探针扫描技术、随机肽库技术、计算机表位预测。表位疫苗需要借助一定的载体才能发挥免疫作用,包括脂质载体、蛋白载体、佐剂等。目前国内外学者还采用多种方法如串联重复、MAP空间模式及表位修饰等方法增强表位疫苗的免疫效果。表位疫苗主要包括病毒表位疫苗、细菌表位疫苗和寄生虫表位疫苗。尽管表位疫苗的研究发展迅速,但仍然面临一些问题亟待解决。     

托佩克猪SLA-1-632-TPK基因的矫正及重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T的构建

猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA）在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失（距离SLA-1-632-TPK基因5'端632 bp处丢失1个碱基"C"）,导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR（splicing overlap extention PCR,SOE-PCR）技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5'和3'端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5'和3'端片段,大小约为650和590 bp,与理论设计值大小（648和585 bp）接近,经过拼接以后,得到全长约1 200 bp,与理论设计值1 223 bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5'端632 bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。     

SOE PCR重构SLA-Ⅰ复合体研究

利用剪接重叠延伸PCR(SOE PCR)技术,中间加一富含甘氨酸/丝氨酸的linker(G4S)3,将SLA-Ⅰ重链基因SLA-2和轻链基因β2m连接,形成复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,然后将复合体基因链克隆入p2X表达质粒,导入受体菌TB1并进行表达。结果显示,利用SOE PCR技术成功得到了复合体基因链SLA-2-(G4S)3-β2m,并且克隆入p2X载体。SDS-PAGE检测表明,复合体基因导入宿主菌后获得了融合蛋白MBP-SLA-2-(G4S)3-β2m,大小为84.1 ku。试验结果为今后在体外进行相关基因重组表达提供参考。