猪GV/MⅡ期卵母细胞miRNAs表达谱及Npm2基因相关miRNAs筛选

旨在探索体外成熟前后猪卵母细胞miRNAs表达谱，并筛选参与调控Npm2基因表达的miRNAs。本试验回收屠宰场猪卵巢，收集GV期卵母细胞，经体外成熟培养后获得MⅡ期卵母细胞，分别提取约130个GV期和MⅡ期卵母细胞总RNA进行Illumina HiSeqTM 2500测序，获取miRNA测序数据，每个处理重复3次，筛选差异表达microRNAs并进行靶基因GO和KEGG聚类分析。结果表明，本研究成功构建了GV期和MⅡ期猪卵母细胞miRNAs表达谱，GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs有95个，具有相似表达模式的miRNA聚为一类，对95个差异表达miRNAs进行靶基因预测，共得到3 967个靶基因，经GO和KEGG富集分析表明，这些靶基因被富集于5 194个GO条目和212个信号通路，其中参与卵母细胞减数分裂成熟的信号通路有2个。在差异表达miRNAs中筛选到5个与Npm2基因相关的miRNAs。采用qRT-PCR对其中2个miRNAs进行验证，证实其表达趋势与测序结果一致。本研究筛选了GV期和MⅡ期卵母细胞差异表达miRNAs，推测差异表达的miRNAs可能通过代谢、卵母细胞减数分裂相关通路、孕激素介导的卵母细胞成熟通路等途径在卵母细胞体外成熟过程中发挥作用，并筛选出调控Npm2基因表达的miRNAs，研究结果可为进一步阐明miRNA对Npm2基因的调控及其在卵母细胞成熟过程中的作用提供依据。     

离心参数对猪卵母细胞早期去脂效果的影响

【目的】卵母细胞脂肪含量较高是影响猪卵母细胞和胚胎冷冻效果不佳的主要原因,离心去脂可以提高冷冻成功率。本研究选用不同离心参数对猪卵母细胞进行离心去脂,通过研究其对卵母细胞早期去脂效果及其去脂后克隆胚胎的体内外发育和冷冻的影响,筛选最适离心参数。【方法】设定不同离心参数对猪卵母细胞进行早期去脂,利用体细胞克隆技术构建重构胚,通过离心后卵母细胞脂肪层的分离、重构胚的卵裂率和囊胚率、冷冻—解冻后的存活率以及代孕母猪妊娠等分析重构胚玻璃化冷冻前后体内外的发育效果。【结果】离心转数为10 000 r/min、离心时间为20 min时,卵母细胞的早期去脂效果最好。早期去脂重构胚的卵裂率和囊胚率分别是65.38%和13.46%;冷冻—解冻的2~4细胞、5~8细胞、9~16细胞的重构胚的存活率和囊胚率分别为49.09%、52.75%、78.57%和12.72%、2.20%、21.42%,而且冷冻胚胎移植到代孕母猪体内后成功妊娠。【结论】本研究证明了猪卵母细胞早期去脂可直接用于胚胎冷冻,最适离心参数为10 000 r/min×20 min。     

玻璃化冷冻对猪MⅡ卵母细胞皮质颗粒分布及其激活后胚胎发育能力的影响

本实验旨在探讨玻璃化冷冻保存对猪MⅡ期卵母细胞皮质颗粒分布和孤雌激活后早期胚胎发育能力的影响。实验将卵母细胞随机分为对照组、毒性实验组和冷冻组。采用EFS40和EDFS40两种玻璃化冷冻液处理,卵母细胞经恢复后对其进行染色,观察皮质颗粒的分布;并对另一部分卵母细胞实施孤雌激活,观察早期胚胎的发育。结果表明:毒性实验组和冷冻组卵母细胞皮质颗粒部分释放、完全释放的比例无显著差异,但均显著高于对照组(P<0.05)。不同毒性处理组和不同冷冻组间对皮质颗粒的分布无显著差异。与毒性实验组相比,冷冻处理组显著降低皮质颗粒在皮质区分布的比例(P<0.05)。EFS40毒性实验组孤雌激活后的存活率、卵裂率、囊胚发育率均显著高于EDFS40毒性实验组(86.6%vs.75.0%)、(61.8%vs.40.7%)、(30.2%vs.23.5%)(P<0.05)。EFS40冷冻组存活率显著高于EDFS40冷冻组,但均显著低于对照组。结果显示,抗冻保护剂处理和玻璃化冷冻均导致猪卵母细胞皮质颗粒释放,与EDFS40相比采用EFS40较适合猪MⅡ期卵母细胞冷冻保存。     

不同浓度紫杉醇预处理对绵羊卵母细胞玻璃化冷冻保存效果的影响

细胞骨架系统的稳定对于提高卵母细胞或胚胎冷冻后的存活率及其发育能力具有重要作用。紫杉醇(Taxol)作为细胞骨架稳定剂,可增强α、β-微管蛋白二聚体的紧密联系,增大微管交联,促进微管聚合和稳定。本实验以绵羊体外成熟卵母细胞为材料,旨在探讨紫杉醇预处理对玻璃化冷冻绵羊卵母细胞存活率、形态正常率及体外受精后胚胎发育率的影响。采用0、0.5、1.0、1.5μmol/L的紫杉醇预处理绵羊卵母细胞并进行玻璃化冷冻保存,未经处理的新鲜卵母细胞为对照组。结果表明:采用浓度为0.5μmol/L紫杉醇预处理绵羊卵母细胞冷冻保存效果最佳,其解冻后的存活率(82.38%)与其他3个试验组相比有显著差异性(P0.05);体外受精卵裂率(51.17%)和桑囊胚率(20.30%)也显著高于其他3个试验组(P0.05),但低于对照组(69.42%,34.77%)(P0.05)。由此可见,以0.5μmol/L浓度的紫杉醇预处理组绵羊体外成熟卵母细胞冷冻后能获得较好的效果。     

不同年龄二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞的生物学特性

采用胶原酶消化法建立细胞系,观察细胞形态、测定细胞冻存前和复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线,并对染色体核型进行分析,研究不同年龄的二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞的生物学特性,分析年龄对二狼山绒山羊耳组织成纤维细胞体外培养的影响。试验结果表明,年龄对细胞形态无影响;冻存没有降低细胞的存活率(P0.05);细胞的生长曲线呈典型的S型且年龄对细胞的生长无明显影响(P0.05);染色体核型分析显示,不同年龄的山羊耳组织成纤维细胞系的染色体数目均为2 n=60(XY/XY),无染色体畸形。说明不同年龄,甚至年龄比较大的二狼山绒山羊个体(13岁)都可以通过胶原酶消化法建成稳定的成纤维细胞系,本试验使二狼山绒山羊种质资源在细胞水平得到保存,为二狼山绒山羊成纤维细胞系的建立以及开展其种质资源的保存提供一定的参考。