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【目的】了解广东省某猪群中猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株的遗传进化情况,丰富 PCV2 分子流行病学数据,为当地 PCV2 疫苗候选株的选用和研发提供参考。【方法】使用 qPCR 方法对疑似 PCV2 的样品进行检测,发现 1 株具有高病毒载量的 PCV2 毒株,命名为 GD222858。通过 PCR 方法进行全基因组分子克隆及遗传进化分析。使用 MegAlign 软件将该毒株 ORF1、ORF2 基因编码的氨基酸序列与 PCV2 同亚型参考毒株进行比对,分析氨基酸序列的相似性;采用 DNAStar 预测该毒株的 Cap 蛋白二级结构及 B 细胞表位,并与 4 株疫苗株 DBN-SX07-2(HM641752)、LG(HM038034)、SH(HM038027)、ZJ(AY686764)的 Cap 蛋白抗原指数进行比对分析。【结果】GD222858 毒株基因组长度为 1 767 bp。遗传进化分析表明该毒株属于 PCV2d 亚型。与国内外 82 株参考毒株的核苷酸相似性为 91.4%~99.6%,与越南毒株 Han8(GenBank 登录号:JQ181600)的亲缘关系最近。在 ORF1 编码的 Rep 蛋白处发现多个特异性突变位点 F70Y、F77L、W202R、N256S;ORF2 编码的Cap 蛋白相对保守。Protean 预测 Cap 蛋白的氨基酸第 5~18、24~25、39~41、48~49、57~65、99、101、112~114、139~140、145~150、162~165、175~181、188~189、205~211、227~232 位 置 处 均 可 能 存 在 潜 在 的 B 细 胞 表 位。GD222858 毒株的 Cap 蛋白抗原指数与 4 株疫苗株均有差异,在氨基酸 45~57、124~132、223~233 位置处抗原指数明显高于 4 株疫苗株,且与疫苗株 HM038034 差异最大。【结论】GD222858 毒株感染猪群的原因可能是 Rep 蛋白多个位点发生特异性突变及疫苗株选用不当所致。 相似文献
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以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7,其染色体平均数为98~103,间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1:3125、1:3125、1:15625,小鼠腹水效价分别为1:390000、1:390000、1:1950000.ELISA结果显示,1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应,而与PET-32a载体表达的蛋白不反应.相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点.间接免疫荧光结果显示,1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应,而不与PCV1发生交叉反应.结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的,为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础. 相似文献
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【目的】 研究纳米银(silver nanoparticles,AgNPs)体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的作用,并初步分析其抗病毒作用机制,为PRRSV的防控提供新思路。【方法】 使用0.1875、0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL AgNPs处理Marc145细胞,采用CCK-8试剂盒评估AgNPs对Marc145细胞毒性,确定其安全浓度。通过显微观察、间接免疫荧光试验、病毒滴度测定、实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs体外抗PRRSV感染Marc145细胞的效果。通过间接免疫荧光试验和实时荧光定量RT-PCR方法评估AgNPs对PRRSV的直接灭活效果。通过实时荧光定量RT-PCR方法分析AgNPs对不同感染复数(multiplicity of infection,MOI) PRRSV (0.0001~0.1)黏附和入侵Marc145细胞的影响,以及PRRSV感染Marc145细胞3、6、12、18和24 h后加入AgNPs对Marc145细胞增殖的影响。【结果】 AgNPs对Marc145细胞的最大安全浓度为1.5 μg/mL,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均具有良好的体外抗PRRSV活性,0.375、0.75、1.5 μg/mL AgNPs均对PRRSV起一定灭活作用。AgNPs对不同MOI的毒株黏附和入侵Marc145细胞均有一定抑制作用,且不同时间(3、6、12、18、24 h)加入AgNPs对PRRSV增殖均有一定抑制作用。【结论】 AgNPs具有良好的体外抗PRRSV活性,体外抗PRRSV的作用机制包括直接灭活以及抑制病毒的黏附、入侵和增殖过程。 相似文献
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2013年11月从广州某猪场发生急性败血症死亡的母猪心脏、肺脏、脾脏分离到1株病原菌,经形态学观察、培养特性、生化特性及16SrRNA、spaA基因测序,确定为猪红斑丹毒丝菌,命名为GZ株。结果表明,该菌株对阿莫西林、利福平、庆大霉素、头孢类抗生素高度敏感,对其他药物广泛耐药,对BALB/c小鼠的致死剂量为1.5×108 cfu/mL。测序结果与NCBI收录的猪红斑丹毒丝菌进行Blast比对分析,16SrRNA基因与不同地区分离自人、蛋鸡、猪、白海雕、野猪、野兔、鼠等动物的同源性为95.9%~99.8%。spaA基因与NCBI收录的分离菌株核苷酸同源性为98.9%~99.9%,氨基酸同源性为99.5%,3处发生突变,其中,第36位缬氨酸突变为亮氨酸,第203位异亮氨酸突变为蛋氨酸,第257位亮氨酸突变为异亮氨酸;与1998年和2006年日本1a型Fujisawa株的核苷酸同源性最高,为99.8%,因此确定分离的GZ株为1a血清型。 相似文献
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为分析猪葡萄球菌感染BALB/c小鼠不同时间点血清中炎性细胞因子表达的变化,收集猪葡萄球菌感染BALB/c小鼠不同感染时段(24、48 h)的血清,采用细胞因子抗体芯片技术检测32种细胞因子水平。结果显示,猪葡萄球菌感染小鼠后血清细胞因子表达水平发生了明显变化:与对照相比,感染后24 h,血清细胞因子中有5种细胞因子表达出现了显著性变化,其中表达升高2倍以上的细胞因子有4种(G-CSF、IL-6、KC、MCP-5);感染后48 h,血清细胞因子中共有4种细胞因子表达出现了显著性变化,其中表达升高2倍以上的细胞因子有3种(G-CSF、KC、MCP-5);感染24 h和48 h后IL-12的表达均显著低于对照。炎性细胞因子在猪葡萄球菌感染中发挥重要作用,利用细胞因子抗体芯片从血清中筛选猪葡萄球菌相关蛋白分子标记物是可行的。 相似文献
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为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×101 copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。 相似文献
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随着对蛋白质类药物和疫苗等众多基于细胞培养的生物制品需求量及质量要求的不断提高,多种动物细胞规模化培养技术应运而生并不断发展,尤其悬浮培养技术的出现,成功突破了动物细胞规模化培养的传统障碍。了解不同动物细胞规模化培养技术(尤其悬浮培养技术)的发展及优缺点,诸如适于单细胞全悬浮培养的贴壁细胞的筛选驯化,微载体技术的突破,无血清乃至化学成分限定性培养基的开发,生物反应器的更新,以及连续培养及灌注培养的改进等,选择合适的规模化培养技术,实现细胞的高密度培养,将更好的应对生物制药行业的发展及需求。 相似文献
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猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析 总被引:3,自引:0,他引:3
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)0RF2基因序列,设计一对引物,应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序,结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92.1%~99.9%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.2%~99.5%之间。 相似文献
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猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达 总被引:3,自引:1,他引:3
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增,将扩增的ORF1基因克隆入pMD18~T载体,获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD/gⅢ C得到重组子,命名为pBAD/gⅢ—ORF1。序列分析表明,克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99.5%;与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92.1%~99.9%,推导的氨基酸序列同源性为90.2%~99.5%。同时,测序结果表明,克隆的ORF1准确插入了pBAD/gⅢC的多克隆位点,未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析,结果表明PCV-2ORF1在pBAD/gⅢC中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为41ku。 相似文献