SC1(pluripotin)对昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的影响

比较了在无血清培养体系中分别添加小分子化学物质pluripotin(SCl)和白血病抑制因子(LIF)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度.以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)为饲养层,以含LIF的添加血清替代品(KSR)的培养基(ESC-SR)为对照,分别用SC1浓度为0.3、1、3μmol/L的ESC-SR培养液对昆明小鼠胚胎进行分离培养.结果显示:胚胎在添加3 μmol/L SC1的ESC-SR培养液中ICM形成率显著高于对照组(P＜0.05),形成的ES集落与对照组形态差异不明显,最高传至第7代,并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态.不同浓度SC1培养液中,胚胎在SC1浓度为0.3 μmol/L组的F2代形成率显著高于1 μmol/L组和3μmol/L组(P＜0.05),所分离的细胞AKP染色呈阳性,Oct4、Nanog和Sox2的免疫荧光染色均显阳性,具有ES细胞的特点.结果表明,ESC-SR培养液中SC1可以替代LIF用于小鼠ES细胞未分化状态的维持,并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养.     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存

对分离获得的兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行低温冻存研究。用红细胞裂解法体外分离培养BMSCs,采用SABC法进行鉴定;冻存后复苏,台盼蓝染色检测细胞复苏率,观察冻存时间(15d,30d,90d)对各代(P1,P3,P9代)细胞复苏效果的影响;向脂肪细胞诱导分化验证其干细胞多潜能分化特性。结果表明:BMSCs呈长梭形,聚集成旋涡状均匀生长,SABC法鉴定其为BMSCs;冻存前后P1、P3代细胞活力好,增殖速度快;P9代细胞增殖缓慢;冻存时间对P1、P3代细胞复苏率的影响不显著(P0.05),复苏率较高;但是P9代细胞复苏率极低,并且随着冻存时间的延长,细胞复苏率逐渐降低;冻存复苏的细胞向脂肪细胞诱导分化,油红浸染红色。可见:红细胞裂解液法分离获得的BMSCs生长生物学性状稳定;P3代以前冻存增殖和分化特性不受影响,可作为种子细胞用于后续研究。     

郏县红牛同期发情及超数排卵的研究

[目的]探讨生产中郏县红牛同期发情及超数排卵的方法。[方法]筛选75头郏县红牛分组分批进行同期发情及超数排卵。[结果]显示,CIDR+PG法处理组母牛同期发情率(100%)显著高于PG二次法处理组(76%)(P0.05);用加拿大促卵泡素(FSH)超排时头均获胚数6.33枚,用中科院动物所促卵泡素(FSH)超排时头均获胚数为6.00枚,二者差异不显著(P0.05)。[结论]分析结果可知,CIDR+PG法处理比PG二次法对郏县红牛的同期发情效果好;进口促卵泡素(FSH)与国产促卵泡素(FSH)对郏县红牛的超排效果无显著差异。     

DMSO对兔骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的影响

红细胞裂解法分离获得兔骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),传代纯化培养并进行生物特性的鉴定。不同浓度二甲基亚砜(DMSO)(0、0.5%、1%、2%、4%)作用于贴壁前、贴壁后的兔BM-MSCs,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察细胞的形态、生长情况。DMSO体外诱导P3代兔BM-MSCs分化为胰岛细胞,观察诱导前后细胞形态学变化;双硫腙染色法初步鉴定胰岛细胞;免疫细胞化学检测胰岛素的表达;ELISA检测胰岛素的分泌。结果显示,原代、传代细胞呈成纤维细胞样,生长良好。DMSO对细胞的生长有抑制作用,细胞贴壁前、后的2种处理方法相比,DMSO对细胞生长抑制作用差异不显著(P0.05)。相对而言,DMSO浓度1%对细胞的生长损害作用较小。诱导分化过程中,细胞变圆,逐渐聚集,6d出现细胞聚集,随着诱导的继续,形成细胞团样结构,细胞团数逐渐增多;终末阶段试验组双硫腙染色呈明显的猩红色、免疫细胞化学法鉴定胰岛素表达显示阳性,ELISA检测细胞分泌胰岛素,诱导组7d和12d的胰岛素含量分别为(31.32±0.14)mU/L和(32.85±0.21)mU/L,与对照组的(25.02±0.55)mU/L和(25.06±2.46)mU/L比较,差异极显著。结果表明,DMSO可以用于诱导BM-MSCs分化,终末阶段形成分泌胰岛素的功能细胞,未来可以针对其诱导的高效性进一步进行研究。