TGF-β调节仔猪睾丸支持细胞增殖的机制

旨在研究TGF-β对仔猪睾丸支持细胞增殖相关蛋白及基因表达的影响,进一步揭示TGF-β调控仔猪支持细胞增殖的作用机制。本研究用TGF-β及TGF-β/Smad通路抑制剂LY2109761处理培养的仔猪睾丸支持细胞,通过CCK-8与流式细胞术检测支持细胞活性和细胞周期,Western blotting检测Smad3的蛋白磷酸化水平,实时定量PCR(RT-qPCR)检测c-Myc mRNA、Skp2mRNA及ssc-miRNA-24的表达。此外,支持细胞转染ssc-miRNA-24模拟物、抑制剂后,用TGF-β处理支持细胞,检测相关基因和蛋白的表达。结果表明,TGF-β以剂量依赖方式影响支持细胞活性;180pg·mL-1 TGF-β以时间(0~24h)依赖方式影响细胞增殖指数(Proliferation index,PI)和S期细胞比例(S-phase cell fraction,SPF),抑制Smad3磷酸化,增加c-Myc mRNA、Skp2mRNA、ssc-miRNA-24的表达;10μmol·L-1 LY2109761促进TGF-β诱导支持细胞活性,并增加细胞增殖指数和S期细胞比例。ssc-miRNA-24模拟物抑制Smad3磷酸化,促进c-Myc、Skp2 mRNA表达;ssc-miRNA-24抑制剂则具有相反的效果。综上表明,在仔猪睾丸支持细胞中,TGF-β可通过增加ssc-miRNA-24的表达,抑制Smad3磷酸化,增强c-Myc与Skp2mRNA的表达,促进支持细胞增殖。     

TNF-α对仔猪睾丸支持细胞中Fas/FasL表达的调节作用

本研究旨在探索TNF-α对睾丸支持细胞(SCs)中Fas/FasL表达的影响及机制。用不同质量浓度的TNF-α(0.0,0.1,1.0,10.0,25.0,50.0,100.0,200.0μg/L)处理SCs不同时间(0,6,12,24,36,48,72h)后,采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖;通过流式细胞术检测细胞周期进程和细胞凋亡;用Western blot和荧光定量PCR技术检测Fas/FasL、MMP-2/MMP-9和TIMP-2/TIMP-1蛋白水平及其mRNA丰度;利用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IGF-1、TGF-β1等细胞因子水平。结果显示,当TNF-α质量浓度为50.0μg/L、作用时间为36h时,细胞的增殖活力最低;这一条件显著促进了Fas/FasL、MMP-2/MMP-9蛋白及mRNA的表达(P0.05),极显著降低了TIMP-1和TIMP-2mRNA与蛋白表达(P0.01),且极显著促进了细胞促炎性因子IL-1β和IL-6分泌(P0.01),显著抑制了促生长因子IGF-1和TGF-β1分泌(P0.05)。结果表明:TNF-α以剂量和时间依赖方式诱导SCs中Fas/FasL mRNA及蛋白表达,从而诱发SCs凋亡,且Fas/FasL表达受到MMP-2/MMP-9、TIMP-2/TIMP-1以及细胞因子水平的影响。