日本盛冈地区部分牧场考察报告

2008年3月30日至4月6日．笔者在日本岩手大学学术交流期间．考察了日本盛冈地区的小岩井农场的牧场、花平牧场和御明神牧场。现把考察的基本情况和体会总结如下．以便为从事养牛业的人士提供参考和借鉴。     

绵羊白细胞内的慢病毒cDNA gag基因的PCR检测

对5只新疆卡拉库尔羊进行绵羊慢病毒免疫琼脂凝胶扩散检测试验,3只阳性,2只阴性,然后采用PCR技术,以绵羊外周血白细胞基因组为模板,扩增绵羊慢病毒gag基因,将该基因克隆到pBS-T载体上,将重组子转入感受态细胞DH5α,用IPTG/X-gel筛选阳性菌落,通过菌落PCR,酶切初步鉴定后测序,结果表明PCR的检测结果和AGIDT的结果一致,所测序列与Genbank中的Visna病毒的gag基因序列有一定的同源性.     

新疆垦区奶牛乳房炎致病菌的调查

本试验选取新疆垦区7个试验牛场,经临床调查和试剂诊断,检测奶牛712头,采集奶牛乳房炎阳性乳样314份．其中,奶牛隐性乳房炎阳性检出率平均为36．3％,临床性奶牛乳房炎为16．7％．采集阳性奶样经实验室分离鉴定,革兰氏阳性菌仍是引起奶牛乳房炎的主要致病菌,但金色葡萄球菌已基本取代链球菌成为主要的致病菌,其检出率为78．98％．另外,常见环境性致病菌如沙门氏菌、大肠杆菌已明显减少,检出率仅为21．1％和9．24％．相反,绿脓杆菌和蜡样芽孢杆菌的检出率明显增加,其检出率为5．41％和11．15％,而且绿脓杆菌和隐球菌已经引起临床性乳房炎的爆发,其中隐球菌已经成为造成顽固性乳房炎的又一种新型病原。     

竹山县马铃薯晚疫病发生规律研究

平均气温大于17.1℃开始发病,当平均气温在18℃～23℃,夜间温度在10℃左右,多日阴雨后天晴5天晚疫病大流行,高温高湿发病重,随着温湿系数的增大,流行速度增快.不同品种带菌不同,发病程度不同;海拔对发病程度无影响,只影响发病期;不同播种期发病情况有差异,播种期晚,发病晚.     

山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株表达载体的构建

PCR扩增山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55的TK（Thymidine kinase）基因作为侧翼序列;用XhoⅠ/NotⅠ消化含有报告基因的质粒pLSEG得到痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）p7.5启动子调控大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（E.coli.gpt）作为报告基因;人工合成VV I1L启动子用于调控表达外源基因,用Overlap PCR的方法将VV I1L启动子和VV p7.5启动子调控的gpt连接但使两启动子转录方向相背,并在VV I1L启动子下游引入XhoⅠ位点作为外源基因的插入位点,构建成表达载体元件I1L-P7.5-GPT。将I1L-P7.5-GPT插入TK基因的Acc65Ⅰ位点,构建成表达载体。将构建的载体转染山羊痘病毒G14-STV44-55株感染的羔羊睾丸细胞,用含有霉酚酸（Mycophenolic acid,MPA）等筛选试剂的培养基筛选重组山羊痘病毒（rGTPV）。结果显示,构建成以TK基因为侧翼、以VV I1L启动子调控目的基因,以gpt为报告基因的表达载体pGEM-TK-I1L-GPT,成功筛选到表达gpt的rGTPV,rGTPV至少可稳定传代15代。结果表明,构建了我国山羊痘病毒G14-STV44-55疫苗株的表达载体;TK基因是GTPV G14-STV44-55疫苗株的复制非必需区,以TK基因为插入位点获得的重组病毒可稳定传代15代以上。     

布鲁菌铁转录调控因子rirA基因突变株的构建与鉴定

为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。     

牛病毒性腹泻病毒实时定量RT-PCR检测技术的建立及初步应用

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因5'-非编码区为参考,设计、优化一对特异的荧光定量PCR引物,应用Smart CycleⅡ分析系统,结合Eva Green荧光染料结合原理,建立一种快速、定量检测牛病毒性腹泻病毒的荧光定量PCR技术。该方法线形范围为101~106copies/μL,相关系数为R2=0.997,扩增效率为E=0.78。灵敏性比常规PCR高102倍。该方法具有良好的特异性,检测变异系数低于1%。应用本实验建立的方法检测25份不同地区采集的临床症状疑似BVDV感染的牛粪样品,阳性检出率为72%(18/25),与病毒分离培养和电检观察相比,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优点,为实验室快速、准确检测BVDV奠定了基础。     

山羊痘病毒疫苗株RR基因的克隆与序列分析

用绵羊睾丸细胞培养山羊痘病毒疫苗株G14-STV44-55,提取其基因组为模板,设计还原酶(RR)基因的特异引物进行PCR扩增,并克隆至pGEM-TEasy载体,蓝白斑筛选,酶切和测序签定,并对目的基因进行了序列分析。结果获得了RR基因的阳性克隆PGM-RR,DNA片段长度2 669 bp,内存在BglII等4个单一限制性内切酶酶切位点,编码区5′端含有早期转录终止信号TTTTTN(T)T。RR基因核苷酸和推测的氨基酸同源性与GENEBANK中发表的9个参考毒株的同源性分别在97%和99%以上,说明羊痘病毒RR基因具有高度的保守性。     

畜产品中布鲁氏菌巢氏PCR快速诊断方法研究

布鲁氏菌是一种兼性细胞内寄生的动物源性致病菌,侵袭力强、传染途径多、宿主种类多。布鲁氏菌病难预防、难根除、易反复发作难治愈,人类对该菌易感,目前还尚无良好疫苗预防本病。该病受到各国政府及医学、兽医学工作者的高度重视,开展了大量的有关布鲁氏菌的研究工作,特别是在该病多发地区和国家,对其研究内容较多而且深入。据近些年报道一些常见的动物产品如肉类产品、乳制品、毛、皮、皮毛制品、动物内脏食品、精液、分泌液、胃液等储菌源,甚至鲜奶、干酪、黄油和冰淇淋都有携带布鲁氏菌的危险。这些带菌的动物产品,大大地增加了畜产品经营、生产、加工人员以及消费者感染布鲁氏菌病的机会。     

K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序

利用重叠延伸PCR技术将K88ac STⅡ融合基因克隆于T载体上,将重组基因质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,通过PCR、NcoI/XcoI酶切后测序,与genbank报道的K88ac结构基因序列进行比对,证明所克隆的目的片段为K88ac STII融合基因。