新城疫病毒在感染早期通过Akt/mTOR/4E-BP1和p38/Erk/Mnk1通路激活宿主真核翻译起始因子eIF4E的研究

为阐明新城疫病毒(NDV)在感染宿主细胞后对宿主真核翻译起始因子以及相关调控通路的调节作用,本实验采用western blot检测NDV感染He La细胞早期真核翻译起始因子e IF4F的磷酸化水平以及Akt/m TOR/4E-BP1和p38/Erk/Mnk1调控通路的活化情况,同时用紫外线(UV)灭活的NDV进行对照试验。结果显示,NDV感染He La早期能够迅速诱导真核起始因子e IF4E的磷酸化,而UV灭活NDV作用的细胞则无此现象。通过对相关调控通路的检测发现,NDV在感染早期对e IF4E的磷酸化是通过激活p38/Erk/Mnk1通路实现的。此外,NDV感染还可以激活Akt/m TOR/4E-BP1通路,诱导e IF4E阻遏蛋白4E-BP1发生磷酸化并解离出e IF4E,从而促进e IF4F复合体的形成,确保真核翻译的进行。该结果对深入解析NDV与宿主之间的相互作用以及翻译相关信号通路参与调控病毒复制的机制具有重要意义。     

鸡高迁移率蛋白1双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立鸡高迁移率族蛋白1(chHMGB1)蛋白酶联免疫定量分析方法,本研究原核表达重组ch HMGB1蛋白(rchHMGB1)。以纯化的rchHMGB1作为免疫原分别免疫BABL/c小鼠和新西兰大白兔以分别制备针对rchHMGB1的鼠单克隆抗体(MAb)和兔多克隆抗体(PAb),并对兔PAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。以鼠抗rchHMGB1 MAb做为包被抗体,HRP标记兔PAb为检测抗体,建立了定量测定rchHMGB1的双抗体夹心ELISA方法。对该方法进行了特异性、检测限和稳定性等试验。结果显示,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为1∶500稀释,抗原浓度在72.5 ng/mL~75μg/mL范围内呈良好线性关系,相关系数R20.99。该方法可以特异性检测rchHMGB1,最低检测限为36.25 ng/mL,连续6 d检测抗原绘制的标准曲线稳定性良好。本实验建立的rchHMGB1双抗体夹心ELISA方法,灵敏度较高,重复性好,为进一步研究chHMGB1在疾病感染过程中发挥的病理学机制奠定基础。     

鸡源性HMGB1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

从鸡胚原代细胞CEF中扩增出鸡HMGB1基因,构建重组原核表达质粒p ET-28a-ch HMGB1,并将p ET-28a-ch HMGB1转入大肠杆菌BL21(DE3)中,于37℃进行诱导表达,经SDS-PAGE分析表明该重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达且以可溶性蛋白的形式存在。蛋白通过Ni-NAT纯化树脂亲和纯化,并作为免疫原制备鼠抗ch HMGB1多克隆抗体血清。该多克隆抗体同时具有ELISA、Western blot和IFA效价,且特异性识别禽源细胞内HMGB1蛋白。     

HeLa细胞中泛素蛋白酶体系统对新城疫病毒复制的影响

本文主要对细胞的泛素-蛋白酶体系统是否参与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的复制过程进行了研究。用NDV感染HeLa细胞,对细胞样品进行Western blot实验,并检测细胞26S蛋白酶体的三种蛋白水解活性变化。同时使用多种泛素-蛋白酶体系统相关的抑制剂处理细胞并做NDV感染,测定细胞上清中病毒TCID50值,比较药物处理与DMSO处理对病毒增殖的影响。结果表明,HeLa细胞在感染NDV后,细胞内泛素化蛋白水平降低,而26S蛋白酶体的三种蛋白水解活性都显著升高;使用泛素-蛋白酶体系统抑制剂后NDV的增殖受到了明显的抑制,证明NDV在HeLa细胞内的增殖与细胞自身的泛素-蛋白酶体系统关系密切。