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为降低RNAi技术的毒副作用,筛选高效抑制猪瘟病毒复制的shRNA序列,根据有关报道构建了荧光报告系统shRNA筛选平台。该平台以9种抑制效率分别为强、中、弱的shRNA筛选载体作为参照,结合荧光报告系统进一步量化shRNA的抑制效率。根据2种已知体外有效抑制猪瘟病毒复制的siRNA-N2、siRNA-NSSB,分别设计得到shRNA-N2、shRNA-NS5B表达栽体,继而采用高效、高灵敏度的shRNA筛选平台对这2种shRNA进行了检测,结果显示单拷贝情况下,shRNA-N2抑制靶序列效率较强,shRNA-NSSB抑制效率弱。本试验通过新策略大大提高了shRNA干扰效率检测的灵敏度,为采用shRNA转基因克隆动物进行抗病育种的研究提供了保障。 相似文献
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猪MSTN基因敲除载体的构建及细胞筛选 总被引:1,自引:0,他引:1
构建猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因的打靶载体并获得敲除MSTN基因的猪胎儿成纤维细胞.以Puro为正筛选基因,白喉毒素-A(DT-A)为负筛选基因.将同源长臂和同源短臂分别插入Puro基因的两侧.同源长短臂分别为4 294 bp和1 015 bp,定点敲除MSTN基因的部分内含子2和部分外显子3.采用FugeneHD 转染法将打靶载体转入37 d的猪胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞采用嘌呤霉素筛选.结果显示,成功构建了对猪MSTN基因部分区域进行敲除的打靶载体,共得到48个具有药物抗性的细胞克隆,经PCR检测,获得2个正确同源重组的细胞克隆. 相似文献
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