利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探

为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。     

猪胚胎死亡原因（综述）

纵观这几年的研究成果,母猪死胎的原因不外乎与遗传、环境、营养和疾病等因素有关。现分述如下。一、遗传因素(一)染色体畸变据 C.P.Popescu(1982)研究,猪染色体畸变与胚眙死亡有特别密协的联系。在染色体畸变中,易位比例最高,特别是非同源染色体之间的交互易位,会同染色体分配不平衡而产生染色体不平衡的配子,这些配子受精的结果是产生带有不平衡核型的胚胎,这些缺损核型都是致死性的,致使分     

猪胚胎移植技术研究进展

胚胎移植早在1890年首先在兔获得成功,但直至本世纪30年代以后,胚胎移植才引起普遍的重视.山羊、猪和牛的胚胎移植开始于50年代初,而真正作为畜牧生产技术加以应用则是60年代的事。牛的胚胎移植发展最快,应用得也最广泛.猪产仔多、繁殖率高,用胚胎移植从少数优良个体获得较多后代的要求不像对牛那样迫切。尽管如此,猪胚胎移植还是有很广阔发展     

姜曲海母猪发情周期性腺激素及其子宫受体含量的变化规律

以长白猪为对照,测定了姜曲海母猪发情周期血浆中雌二醇和孕酮及其子宫受体含量。发现发情期血浆雌二醇的峰值为58.3±3.9pg/ml,与长白猪比差异不显著。间情期孕酮的最高水平和平均水平均比长白猪高(23.25±1.36对14.28±1.42ng/ml和18.56±1.42对11.76±0.57ng/ml,P<0.01)。发情期和间情期的细胞质雌二醇受体(CER)分别为 410±30.3和367±14.2fmol/mgDNA,其kd值分别为4.8±0.65和4.0±0.8nmol;细胞核雌二醇受体(NER)分别为1390±195.3和620±28.9fmol/mgDNA,其kd值为6.6±2.1和4.4±1.3nmol;细胞质孕酮受体(CPR)分别为364±56.0和147±46.0 fmol/mgDNA;细胞核孕酮受体(NPR)分别为337±51.8和184±67.0fmol/mgDNA。发情期和间情期子宫NER含量较长白猪高(P<0.05),说明此时姜曲海母猪子宫对雌二醇具有较高的敏感性。     

过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体的抗衰老作用

NAMPT是NAD+补救合成途径的限速酶,具有抗衰老作用.外泌体是一种包含蛋白质、miRNA、mRNA、lncRNA等内容物的天然内源性载体.利用慢病毒方法构建NAMPT过表达的人脐带间充质干细胞系,获得过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体,随后通过与人皮肤成纤维细胞共培养和饲喂秀丽隐杆线虫,研究过表达NAMPT脐带间充质干细胞外泌体对其抗衰老的影响.结果表明:基因修饰后脐带间充质干细胞及其外泌体内NAMPT蛋白含量显著升高,并能促进人皮肤成纤维细胞增殖和延缓人皮肤成纤维细胞衰老;同时能延长秀丽隐杆线虫寿命和增加秀丽隐杆线虫抗氧化能力.这一研究提示过表达NAMPT基因的间充质干细胞外泌体具有一定的抗衰老作用.     

内质网应激标记基因Grp78参与鹅肥肝免疫/炎症状态的调控

旨在揭示内质网应激(ERS)标记基因Grp78是否参与鹅肥肝中炎症/免疫相关基因的表达调控。本试验选择健康的、体重相近的70日龄朗德鹅30只(未分公母),随机分为对照组(n=15)和填饲组(n=15)。利用荧光定量PCR测定不同填饲阶段(填饲7、14、19 d)不同组织中Grp78的相对表达量(n=4),以明晰Grp78与鹅肥肝形成的关联;在鹅原代肝细胞中过表达Grp78,并通过RNA-seq分析Grp78所影响的信号通路和基因(n=3);利用荧光定量PCR检测鹅肥肝中与炎症/免疫相关的基因表达量(n=4),以明晰这些基因与Grp78的关联。结果表明,肝和腹脂中Grp78的表达量受填饲影响(肝中下降,而腹脂中上升)。Grp78基因的过表达试验表明,ERS除了可影响已知的代谢病和细胞凋亡通路外,还影响信号转导、免疫等通路。在免疫/炎症方面,"Toll-like receptor signaling pathway"、"TNFαsignaling pathway"、"NF-kappa B signaling pathway"等通路最为突出。此外,免疫/炎症相关基因Tnfsf10、Map3k7cl在鹅原代细胞中的表达受Grp78过表达影响,在鹅肥肝中受填饲影响。总之,本研究揭示了Grp78/ERS新的生物学功能,即对细胞的免疫/炎症状态进行调控,并借此参与鹅肥肝的形成。     

环境因素对丰年虾孵化的影响及孵化条件优化

文章采用单因素和正交试验探究各种环境因素对丰年虾孵化率影响,对丰年虾孵化条件进行优化。试验设定了5个温度梯度(24、26、28、30、32℃)、7个pH梯度(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10)、7个盐度梯度(5‰、10‰、15‰、20‰、25‰、30‰、35‰)、5个时间梯度(20、22、24、26、28 h)。试验结果表明:在一定范围内,单独的温度、pH、盐度及孵化时间对丰年虾的孵化率影响显著,并且协同因素对丰年虾孵化的影响程度存在显著差异。最佳孵化率分别出现在:温度为28℃、pH为9.5、盐度为10‰、孵化时间为22 h。在同一环境下,影响孵化率的主次顺序依次为温度和盐度、孵化时间、pH。通过正交试验得出优化孵化方案,温度为30℃、pH为9.5、盐度为10‰、孵化时间为22 h,该条件下孵化率达89%。     

转座子介导细胞质显微注射技术的基因转移效率比较

为了比较和探索SB(sleeping beauty)、PB(piggyBac)和T012 3种转座子介导下的细胞质显微注射法在小鼠(Mus musculus)和斑马鱼(Danio rerio)上的转基因效率,本研究将包含3种转座子的重组载体pT3-PST-CAG-GFP分别与3种转座酶表达载体以1:1质量比混合,显微注射至小鼠和斑马鱼受精卵细胞质,经体外培养后在胚胎发育不同时期用荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性率,结果显示,在培养至4 Ed(96 h)(Ed: embryo day,胚胎发育的天数)的小鼠胚胎中,PB转座子介导的GFP转基因阳性率最高,达52％(N=281),显著高于SB的47％ (N=328)和To12的36％ (N=273)(P＜0.05);而受精后36和60 h (hour past fertilization,hpf)斑马鱼胚胎中,荧光显微镜检测表明,To12的GFP阳性率分别为36％(N=677)和37％(N=685),显著高于SB(28％ N=691和27％ N=708)和PB(30％ N=687和32％ N=675)(P＜0.05);转座子介导的细胞质显微注射可获得较高的转基因效率,且转座子活性具有物种差异性,在哺乳动物胚胎中PB转座子的基因转移效率最高,而在鱼类胚胎中To12转座子的基因转移效率最高.本研究为提高动物转基因效率研究提供重要参考资料.     

氨基酸螯合铜饲喂生长肥育猪的试验

在大约克夏×姜曲海生长肥育猪的饲粮中，添加氨基酸螯合铜、硫酸铜，饲喂结果表明，饲粮中添加氨基酸螯合铜，促进生长肥育猪增重、改善饲料转化率和经济效益均优于硫酸铜，且肥育前期优于肥育后期。肝脏中Ｃｕ，Ｚｎ，Ｆｅ的含量高于背最长肌含量。血浆中３种徽量元素含量各组差异不显著。