猴源环孢子虫巢式PCR检测方法的建立

环孢子虫是一类可引起人和动物腹泻的重要寄生性原虫。为建立猴源环孢子虫的巢式PCR检测方法,根据该环孢子虫18S rDNA基因序列,设计一对保守引物N18SA/N18SS和一对特异性引物CYJS/CYJA,通过阳性质粒摸索该检测方法的最佳反应条件,进行特异性和敏感性试验,并应用该方法对87份猴粪样本进行了临床检测。结果显示该巢式PCR能特异性地扩增出猴源环孢子虫目的片段,与微小隐孢子虫、阿米巴原虫等8种DNA无交叉反应,最低能检测0.2 fg的阳性质粒DNA,对临床样本的检出率比传统方法(饱和蔗糖漂浮法和改良抗酸染色法)提高2.3%~3.4%。可见,该巢式PCR方法具有较高的特异性和敏感性,对于环孢子虫病的诊断和分子流行病学调查具有重要的应用价值。     

猴源人隐孢子虫的分离与鉴定

为了解感染不同灵长类动物的隐孢子虫种类以及与感染人的人隐孢子虫(C.hominis)之间的遗传差异,本研究采用形态学和分子生物学方法对猴源隐孢子虫进行分离和鉴定。利用常规方法分离猴粪便中的隐孢子虫卵囊,通过改良抗酸染色和荧光显微镜观察对其进行形态学鉴定;并采用PCR方法扩增其卵囊壁蛋白(COWP)基因和18SrRNA基因,扩增产物克隆至pMD-18-T载体中,对阳性克隆进行测序并作进化树分析。结果表明:抗酸染色和荧光检查结果与所报道的人隐孢子虫的结果一致。PCR扩增产物经电泳检测,明显地出现554bp和370bp大小的片段,与预期结果一致;两种基因的序列分析结果显示该猴源隐孢子虫与C.hominis的相似性均为100%。由此可认为本次分离的隐孢子虫为C.hominis。     

菲莱氏温扬球虫18S rDNA基因的扩增与克隆分析

菲莱氏温扬球虫是鸭球虫病的重要病原之一,为了寻找种特异性的遗传标记,本研究采集广东省某鸭场的新鲜鸭粪,通过Sheather’s蔗糖漂浮法收集球虫卵囊,经形态学鉴定为菲莱氏温扬球虫;提取该球虫DNA样品,经过PCR扩增,首次获得了该虫的18S rDNA基因部分片段;对该基因进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系。结果显示,对菲莱氏温扬球虫序列与艾美耳科其他球虫关系较近,系统进化树分析属于艾美耳科的另一分支。表明18S rDNA基因在鸭菲莱氏温扬球虫的分类鉴定上是一种有效的分子标记。     

菲菜氏温扬球虫18S rDNA基因的扩增与克隆分析

菲莱氏温扬球虫是鸭球虫病的重要病原之一,为了寻找种特异性的遗传标记,本研究采集广东省某鸭场的新鲜鸭粪,通过Sheather's蔗糖漂浮法收集球虫卵囊,经形态学鉴定为菲莱氏温扬球虫;提取该球虫DNA样品,经过PCR扩增,首次获得了该虫的18S rDNA基因部分片段;对该基因进行了克隆和测序,比较了该虫株与其他原虫的亲缘关系.结果显示,对菲莱氏温扬球虫序列与艾美耳科其他球虫关系较近,系统进化树分析属于艾美耳科的另一分支.表明18S rDNA基因在鸭菲莱氏温扬球虫的分类鉴定上是一种有效的分子标记.