结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达

以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因的克隆、表达及其免疫活性研究

以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础.     

牛分枝杆菌抗原MPB70、MPB83和ESAT-6的融合表达及重组蛋白的初步应用

应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因mpb70-mpb83后,将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a( )中得到重组质粒pET70-83-E6。转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态后,经IPTG诱导以可溶的形式表达融合蛋白。用Ni2 亲合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病阳性血清不反应。用该纯化蛋白初步建立了间接ELISA方法,并检测了117份临床血清样本(其中67份为PPD阳性牛血清),阳性率为39.32%(46/117)份,与PPD皮试诊断的符合率为82.05%(96/117)。     

牛分枝杆菌ag85b基因的瞬时表达

[目的]为牛结核病DNA疫苗的研制提供参考。[方法]利用PCR技术扩增出牛分枝杆菌ag85b基因片段,克隆到真核载体pcD-NA3.1(+)上,构建重组质粒pcAg85B,将重组质粒转染SP2/0细胞,间接免疫荧光试验检测该基因的表达情况。[结果]结果表明:在转染了重组质粒pcAg85B的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达。[结论]为研究牛分枝杆菌ag85b DNA疫苗奠定了基础。     

牛分枝杆菌esat-6和mpb70-mpb83基因DNA疫苗的免疫效果

用PCR技术和重叠延伸剪接技术获得牛分枝杆菌esat-6基因和mpb70-mpb83融合基因，连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建了重组质粒pCE6和pC70-83-E6。分4组免疫小鼠：pCE6组、pC70—83-E6组、pcDNA3．1（＋）和PBS对照组，采用间接EI。ISA法检测免疫小鼠血清特异性抗体水平，MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况和IFN—y分泌情况。结果表明，2重组质粒免疫组小鼠的血清抗体水平持续上升，而2对照组始终维持在较低水平，且pC70-83-E6组小鼠的抗体水平高于pCE6组。经PPD刺激后，pCE6组和pC70—83-E6组小鼠的SI值与2对照组均差异显著（P〈0．05），2重组质粒免疫组间差异不显著（P〉0．05）；2重组质粒免疫小鼠脾细胞产生的IFN—y均显著高于2对照组（P〈0．05），且pC70-83-E6组明显高于其他3组（P〈0．05）。证实本试验构建的2种牛分枝杆菌DNA疫苗可有效诱导实验动物产生体液免疫和细胞免疫应答。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因重组质粒在鸡体内免疫效果的研究

为检测禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)外膜蛋白H基因的免疫效果,本研究利用PCR技术扩增禽P.multocida的omph基因片段,并克隆于pcDNA3.1(+)中构建重组质粒pOMPH,经体外表达检测后进行动物免疫,实验动物共分4组:pOMPH组、弱毒疫苗组、pcDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组。免疫后对各组鸡进行免疫指标检测,并于三免后两周进行攻毒。结果显示,pOMPH免疫组和弱毒疫苗免疫组血清抗体水平持续上升,与两对照组相比差异极显著(p<0.01),并且pOMPH免疫组血清抗体水平明显高于弱毒疫苗组(p<0.05)。淋巴细胞增殖试验结果也表明,pOMPH和弱毒疫苗组的刺激值(SI值)极显著高于两对照组(p<0.01),并且重组质粒组高于弱毒疫苗组。免疫鸡外周血淋巴细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组(p<0.01),并且pOMPH组高于弱毒疫苗组(p<0.05)。攻毒后pOMPH组和弱毒疫苗组的保护率分别为66.7%和73.3%,表明pOMPH虽然可以为免疫鸡提供一定的保护,但效果不如商品化的弱毒活疫苗,还需采取措施进一步增强其免疫原性。     

牛分枝杆菌ag85b-esat-6融合基因的克隆表达

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、esat-6基因和ag85b-esat-6融合基因,克隆到真核载体pcDNA3.1( )上,构建重组质粒pCAE,将该重组质粒体外转染小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞),间接免疫荧光试验检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功构建了真核表达质粒pCAE,转染后的SP2/0细胞中出现绿色荧光,说明ag85b-esat-6融合基因在SP2/0细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制牛结核病DNA疫苗奠定了基础.     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗诱导小鼠免疫保护效果的观察

重组表达猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要毒力因子基因:apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ、apxⅣ、apfa和omp,以重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP组合免疫小鼠作为试验I组,重组蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢr、OMPr、ApxⅣ和rApfa组合免疫小鼠作为试验Ⅱ组,PBS为对照组,分3次免疫小鼠,采用背部皮下多点注射,每次间隔2周,免疫剂量为0.2 mL/只,3免后1周分别以APP1型菌Shope 4074株(5×109cfu)和APP2型菌S1536株(5×1010cfu)进行攻毒试验。通过小鼠保护率与抗体效价的相关性研究、肺部病理变化及肺脏细菌的分布情况等指标进行综合评价。结果显示,试验Ⅰ组4种重组蛋白特异性抗体水平显著高于其他两组(P<0.05),对APP1型菌攻毒的保护率(9/10)明显高于试验Ⅱ组(5/10)和对照组(0/8),小鼠的免疫保护率与抗体效价之间存在显著正相关;且该组对APP2型菌攻毒的保护作用(无肺脏损伤)也明显优于其它两组(典型肺部损伤)。间接免疫荧光试验表明试验Ⅰ组对肺脏细菌的清除效果也明显优于其他两组。本试验揭示试验Ⅰ组对不同血清型APP攻击能够提供很好的交叉保护作用,从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。     

牛分枝杆菌特异性PCR检测方法的建立及初步应用

根据已发表的牛分枝杆菌的pncA的基因序列，设计和合成了一对可扩增294bp目的片段的引物，建立了特异性检测牛分枝杆菌的PCR方法。对牛分枝杆菌国际参考株和国内分离株成功扩增出294bp的特异性基因片段；对人结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌和草分枝杆菌DNA的PCR扩增结果均为阴性。本PCR方法检测的敏感度可达到50pg。对10份牛分枝杆菌培养阳性和10份阴性样品的DNA分别进行了PCR检测，结果10份阳性样品中有9份样品为PCR扩增阳性，阳性符合率为90％（9／10）；而10份阴性样品则PCR扩增全部为阴性，阴性符合率为100％（10／10）。本方法可做为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

牛分枝杆菌三价组合及融合DNA疫苗免疫效果的研究

分泌性蛋白Ag85B、MPB64和ESAT-6为Mycobacterium boris的主要保护性抗原,在诱导机体免疫反应和抵抗感染中发挥重要作用。本研究以peDNA3．1（＋）为载体,构建了由上述3种抗原基因构成的不同疫苗：3基因融合（peDNA-MPB64-Ag85B-ESAT-6,pCMAE）DNA疫苗和三价（pcDNA-Ag85B＋peDNA-MPB64＋pcDNA-ESAT-6）DNA疫苗,评价各种DNA疫苗诱导的体液免疫、细胞免疫及以BCG攻毒后的免疫保护水平。试验结果表明,多基因融合DNA疫苗免疫后的小鼠血清抗体水平、淋巴细胞增殖（SI值）、gamma interferon（IFN-γ）和interleukin-2（IL-2）水平明显高于其他各组（P〈0．05）,攻毒保护效果也优于多价DNA疫苗,达到了BCG疫苗的免疫保护水平,表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的应用前景。