利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰

人工锌指核酸（zinc finger nucleases,ZFN）在植物和动物细胞中可以有效提高DNA修饰的效率和特异性使它很快就成为当前的一个研究热点。ZFN可使DNA双链断裂,然后依靠细胞中复杂的DNA修复机制修饰特定的基因。本文主要介绍ZFN在生产转基因猪研究中的应用及其未来的应用前景。目前采用传统的基因打靶和体细胞核移植的方法,科学家们已经获得了一批基因敲除猪。然而采用传统的基因打靶技术对哺乳动物体细胞进行遗传修效率较低,而且位点特异性和外源DNA整合效率都难以控制。ZFN能够结合到DNA特定位点上,并产生切割作用,使基因打靶的效率提高了几个数量级。本文将详细介绍目前应用ZFN技术获得基因敲除猪模型的几项研究,以及应用ZFN技术加快生产可用于农业生产和生物医药研究的转基因猪。文中还将讨论ZFN在猪的基因组遗传修饰中的安全性和有效性,以及ZFN技术在生猪产业中的创新性应用。     

利用锌指核酸酶对猪基因组进行定向遗传修饰（续完）

4利用ZFN修饰猪的基因组 早期通过ZFN获得遗传修饰动物的研究开始于将其注射到非洲爪蟾（Xenopus laevis）的卵母细胞中（Bibikova等,2001）。虽然最终没有得到活着的基因敲除蟾蜍,但是这个研究证明了ZFN在活体内具有活性,以及可以通过同源重组介导基因组修饰。     

基于CYB5A 基因的广东小耳花猪群体遗传背景检测…

广东小耳花猪是广东省饲养量最大的地方猪品种,农户自繁自养过程中可能混入外来猪种血缘,实际生产中主要通过表型进行评估和选育。CYB5A基因启动子中的突变位点可以鉴定中外猪种遗传背景,因此可通过分子方法检测广东小耳花猪群体中是否混有外来猪种血缘。采用PCR扩增CYB5A基因启动子并进行单向直接测序,将得到的基因序列进行对比以鉴定变异位点。结果显示,32头种猪和36头后备母猪中均有1头为杂合子AB型,A等位基因频率分别为0.0152和0.0139,其余种猪和后备母猪均为中国猪种纯合子BB型。经卡方检验,种猪和后备母猪群体在检测位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05),表明外来猪种该位点在广东小耳花猪群体内没有受到人工选择。该AB型种母猪毛色表型正常,与纯种广东小耳花猪BB型公猪配种生出6头毛色异常仔猪,其中2头为杂合子AB型。该种母猪与杜洛克公猪配种后生出红毛仔猪,该杂交后代的表型也验证其混有外来猪血缘,表明分子鉴定的准确性。研究结果表明,广东小耳花猪群体的血统基本纯正,只有极少数个体混有外来猪种血缘,通过表型选择与分子辅助育种相结合的方法可以准确、快速地提纯该地方品种。     

应用CRISPR/Cas9 编辑广东 小耳花猪MSTN 基因

MSTN基因是肌肉生长抑制基因,破坏MSTN基因的表达成为提高畜禽肌肉产量的有效途径。通过应用CRISRP/Cas9编辑技术对广东小耳花猪MSTN基因的外显子区域进行编辑,破坏MSTN基因的读码框来抑制其表达,从而提高广东小耳花猪的肌肉产量。共设计了6条靶向MSTN基因3个不同外显子的gRNA,经过T7E1酶切检测和TA克隆分析,发现其中3条gRNA能够发生有效切割,其中切割效率最高的达28.3%,最低为17.0%。gRNA1-1和gRNA3-3突变的广东小耳花猪PEF细胞系,突变效率均在50%以上,其中三号外显子上突变位点的突变率达到61.5%。试验结果为后续进行体细胞核移植,生产MSTN基因编辑的广东小耳花猪奠定了基础。     

杜洛克×陆川猪杂交F1 代MC1R 基因型分析

为了解释杜洛克和陆川猪杂交F_1代毛色分离现象,以5窝黑毛全同胞杜陆仔猪及其母本为对照,利用PCR测序法对4窝毛色异常全同胞杜陆仔猪及其母本的MC1R基因型进行分析。结果表明,5窝黑毛全同胞杜陆仔猪MC1R基因型均为ED1/e,母本MC1R基因型均为ED1/ED1;4窝毛色异常全同胞杜陆仔猪中,黑毛杜陆猪MC1R基因型均为ED1/e,红毛杜陆猪MC1R基因型均为e/e,母本MC1R基因型均为ED1/e。由于纯种杜洛克MC1R基因型为e/e,纯种陆川猪MC1R基因型为ED1/ED1,理论上其杂交F_1代杜陆猪MC1R基因型应该为ED1/e,毛色表现为黑色。研究结果显示,产毛色分离仔猪的母本为杂合子,含有杜洛克血统,因此,杂合子母猪和杜洛克杂交产生MC1R基因型表现为纯种杜洛克所特有的e/e,子代表现为红毛,从分子水平揭示了杜陆猪毛色分离的原因。以MC1R基因为分子标记可以指导猪场快速淘汰杂合子陆川猪母本,迅速纯化基础群。     

CRISPR/Cas9 基因编辑技术在猪育种中的研究进展

我国人工驯化野猪历史悠久,各地区结合当地条件培育出众多具有地方特色的猪种,使我国成为 世界上猪种资源最为丰富的国家。我国大部分地方猪种具有肉质细嫩和肌内脂肪含量高等优良肉质性状,但存 在生长缓慢、瘦肉率低和饲料转化率低等缺点,而利用西方瘦肉型猪进行杂交育种可以弥补我国地方猪种的上 述缺点,可以促进地方猪种生长和提高瘦肉产量,但对肉质性状产生不利影响。此外,瘦肉型猪种的引入也给 我国地方猪种的生存带来严重冲击,导致许多地方猪种数量急剧下降,甚至濒临灭绝。而基因编辑技术的出现 和应用,为地方猪种的遗传改良带来了许多突破性进展。综述 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的发展历程及其在猪 繁殖性能、产肉性能、抗病性能和性别控制等遗传改良中的研究进展,以期加深人们对基因编辑技术在家猪遗 传育种中具有特殊作用的认识。     

陆川猪MC1R和KIT基因型鉴定

为了检测陆川猪种群的纯度,本研究以4个华南地方猪种（莆田黑猪、粤东黑猪、大花白猪、巴马香猪）和3个外来猪种（杜洛克猪、大白猪、长白猪）作为对照,利用PCR测序法对陆川猪群体56个样本的MC1R和KIT基因进行基因型鉴定。测序结果表明,大白猪和长白猪KIT基因内含子17的第1个碱基发生G>A剪接突变,而陆川猪和4个华南地方猪种,以及杜洛克猪中KIT基因型一样,均为野生型的GG基因型;MC1R基因编码区分析表明,以海南野猪MC1R基因型作为参考序列,陆川猪和4个华南地方猪种在MC1R基因编码区存在95Val > Met和102Leu > Pro两个错义突变;MC1R基因非编码区分析表明,与大白猪、长白猪和杜洛克猪相比,陆川猪和4个华南地方猪种MC1R基因的5'UTR分别存在5~6个SNPs,3'UTR存在1个A碱基的缺失。另外,试验对一窝毛色异常的陆川猪仔猪及其亲本的KIT和MC1R基因进行测序分析,结果表明,仔猪及其亲本的KIT基因型均为GG野生型,仔猪和母本的MC1R基因均存在E^D1和E^p两种不同的基因型,父本的MC1R基因型为E^D1,因E^p对应于皮特兰猪的斑块表型,所以初步判定母本渗入了外来猪种的血统。本研究通过检测陆川猪等8个猪种的毛色相关基因KIT和MC1R基因的基因型,证实了中外猪种间在毛色遗传上的分子差异,为今后深入研究猪毛色遗传的分子调控机理提供参考。     

两广小花猪 VRTN 基因突变鉴定及其对胴体与肉质性状影响分析

【目的】VRTN 基因 g.20311_20312ins291 和 g.19034A>C 突变是影响瘦肉型猪胸椎数的突变，该突变可增加胸椎数。探究两广小花猪 VRTN 基因突变频率及其对胴体性状与肉质性状的影响，为两广小花猪的分子选育提供参考。【方法】提取 69 头两广小花猪基因组 DNA 并进行 PCR 扩增，使用凝胶电泳与 TA 克隆分别检测其 VRTN 基因 g.20311_20312ins291 和 g.19034A>C 位点突变情况；测定该群体的胴体性状与肉质性状，根据位点突变情况将该群体分组后使用 t 检验进行分析。【结果】在该群体中发现 5 个个体为携带两个位点突变的杂合子，表明两种突变可能紧密连锁，两种突变频率均为 3.62%。统计分析结果显示，VRTN 连锁突变等位基因并不能显著影响两广小花猪的肋骨数，但能影响胴体性状与肉质性状。其中胴体性状方面，VRTN 基因杂合突变显著提升体直长 4.6%（P < 0.05）和体重 9.6%（P < 0.01），体斜长提高 3.5% 但差异不显著，背膘厚和皮厚分别增加 6.5% 和降低 3.7% 但差异不显著。肉质性状方面，突变杂合子的明度 L、色度指数 a 值和 b 值分别增加了 0.01%、14.7% 和 8.4%，失水率显著上升 51.2%（P < 0.05），剪切力和 pH 值变化差异均不显著。【结论】两广小花猪群体中检测到 VRTN 基因 g.20311_20312ins291 和 g.19034A>C 两种突变但频率较低，两种突变可能存在紧密连锁。VRTN 基因杂合突变不会提高两广小花猪胸椎数，可在一定程度上改善胴体性状，但也会对肉质性状带来不利影响，后续两广小花猪育种需要权衡 VRTN 基因突变对于胴体性状与肉质性状的影响。