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狂犬病病毒为不分节段单链负股的RNA病毒,属弹状病毒科狂犬病病毒属。世界上几乎所有国家都有狂犬病发生,狂犬病病毒能够使所有温血动物发病致死,死亡率高达100%。本研究根据GenBank中的狂犬病病毒M基因序列,选择保守区域设计引物,通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法。结果显示,建立的狂犬病病毒实时荧光定量PCR方法,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,是开展狂犬病的临床检测的有力工具。 相似文献
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【目的】制备卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)RelB蛋白(TroRelB)多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清(多克隆抗体),ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照(免疫前血清)未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。 相似文献
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【目的】纯化获取卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)JAK3(TroJAK3)重组蛋白,为了解TroJAK3蛋白功能、相互作用及抗体制备奠定基础。【方法】应用分子生物学技术构建重组质粒pET-32a-TroJAK3,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测TroJAK3重组蛋白表达情况。【结果】PCR扩增片段长度为3 333 bp,经双酶切鉴定、测序确认序列和开放阅读框正确,结果显示成功构建重组质粒pET-32a-TroJAK3。经终浓度为1 mmol/L IPTG 37℃诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明TroJAK3重组蛋白以包涵体形式大量表达,分子量约为140 ku。经Ni-IDA树脂柱纯化,获得纯化的重组蛋白。Western blot检测结果显示有140 ku的条带,表明TroJAK3重组蛋白能被抗His抗体识别。【结论】成功构建了重组质粒pET-32a-TroJAK3,纯化得到高纯度的TroJAK3融合蛋白。 相似文献
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【目的】比较分析中华鳖、黄沙鳖及黄沙鳖F1代群体的生长性状,以期获得黄沙鳖的性状评价指标,为黄沙鳖优良生长性状的选育提供参考。【方法】中华鳖、黄沙鳖和黄沙鳖F1代种群在相同条件下饲养,养殖1年和2年时分别测量3个鳖群的体重、体长、体宽、裙边长和裙边宽,并进行各性状指标的优劣分析。【结果】中华鳖、黄沙鳖和黄沙鳖F1代种群在相同条件下饲养1年后,3个鳖群的平均体重差异不显著(P>0.05),但在体长、体宽、裙边长和裙边宽指标方面,黄沙鳖F1代极显著优于中华鳖(P<0.01);饲养2年后,黄沙鳖F1代比中华鳖更具生长优势,黄沙鳖F1代与黄沙鳖的生长性状差异不显著(P>0.05),但各项生长指标均有所提高。【结论】对黄沙鳖的后代不断进行筛选,可获得性状优良的黄沙鳖群体。 相似文献
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[目的]明确卵形鲳鲹组织蛋白酶L基因(TroCatL)的遗传进化规律及其组织表达水平,为研究CatL生物学功能及其对病原的抗病机理提供理论依据.[方法]应用RT-PCR和RACE技术克隆TroCatL基因全长cDNA,采用生物信息学方法对其序列特征进行分析;并以实时荧光定量PCR(qPCR)检测TroCatL基因在健康组织中的表达情况及其表达与溶藻弧菌感染的关联性.[结果]TroCatL基因全长cDNA为1492 bp(GenBank登录号MH036350),包括开放阅读框(ORF)1011 bp、5'端非翻译区(5'-UTR)120 bp和3'端非翻译区(3'-UTR)361 bp. TroCatL基因编码336个氨基酸残基,其理论等电点(pI)5.7,预测分子质量37.93 kD,且存在CatL特有的保守结构域(ERFNIN、GNFD和GCXGG基序)及由139Cys、279His和303Asn组成的半胱氨酸蛋白酶保守活性位点.TroCatL氨基酸序列与其他鱼类CatL氨基酸序列的同源性高达83.9%~95.2%,尤其与鲈形目鰤鱼的亲缘关系最近. TroCatL基因mRNA在健康卵形鲳鲹组织中均有表达,以在肝脏中的表达最高,在脑组织中的表达最低.经溶藻弧菌感染后,TroCatL基因mRNA在肝脏、脾脏和血液中的表达水平均上调,肝脏和脾脏中的TroCatL基因mRNA在攻毒后24 h达峰值,血液中的TroCatL基因mRNA在感染后12 h达最高值.[结论]TroCatL蛋白结构域及其催化活性位点在遗传进化过程中较保守,通过参与机体的免疫应答反应,在卵形鲳鲹抵御细菌或病毒侵染的过程中扮演重要角色. 相似文献
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[目的]通过测定广西流行狂犬病毒糖蛋白(G)基因的全序列,了解广西狂犬病的流行趋势和遗传变异规律,为制定广西狂犬病的防控策略提供科学依据.[方法]2000年10月~2007年10月,从广西14个市采集1569份动物脑组织,经RT-PCR检测及小白鼠脑内接种试验分离狂犬病毒,然后对狂犬病毒G基因进行测序分析.[结果]从广西各地共分离获得26株狂犬病毒野毒株,其中犬23份,牛、猪、猫各1份.狂犬病毒G基因核苷酸全长2067 bp,开放阅读框1575bp,编码524个氨基酸.根据G基因核苷酸同源性及遗传进化树分析结果,可将广西流行的狂犬病毒株分成3个群,Ⅰ群15株,其核苷酸同源性为97.7%~99.9%; Ⅱ群10株,其核苷酸同源性为98.0%~99.9%; Ⅲ群只有1株.通过氨基酸变异分析,了解了26株野毒株G基因编码蛋白的氨基酸突变位点.[结论]广西存在3个群的狂犬病毒野毒株,且以Ⅰ群和Ⅱ群流行为主,3个群的氨基酸变异均呈现明显的特异性. 相似文献
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自2000年起从广西各地采集1563份犬脑、4份发病牛脑、1份发病猪脑和1份猫脑组织。通过对这些动物脑组织进行PCR检测及用小白鼠脑内接种试验分离出42株狂犬病毒株,并对N基因3’端455个核苷酸片段进行测序分析。根据核苷酸同源性及遗传进化树分析结果,广西狂犬病流行毒株可分成4个群。Ⅰ群有GX01、GX08、GX09、GX014、GX019、GX091、GX123、GX173、GX174、GX195、GX260、GX443、GX452、GXSIO、GX520、GXBS、GXSL、GXGG、GXLA、GXHX、GXGL、GXNniu、GXWXp共23株,它们的核苷酸同源性在97.6%-100%之间;Ⅱ群有Gx074、Gx219、GX304、GX441、GX442、GX496、GX0510、GXBX、GXBM、CXQZ共10株,它们的核苷酸同源性在98.5%-100%之间;Ⅲ群只有GXN119;Ⅳ群有G)(506、GXS08、GXS09、GX120、GXB03、GXeat、GX201、GX102共8株,它们的核苷酸同源性在99.1%-99.6%之间。进一步氨基酸变异分析得知,与兽用疫苗株E1LA比较,所有42个毒株的第58位氨基酸由P变为S,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群的34株共同发生了H26Y、C40S、S61N、V95L、G106D和P135S位点的变异,Ⅰ群发生了T90N和E110D、Ⅱ群发生了T42S的群特异性变异。氨基酸分析结果与核苷酸同源性、遗传进化树分析结果一致。各群毒株呈现明显的地域分布特征,Ⅰ群主要分布在桂东地区,Ⅱ群主要分布在桂西地区。Ⅳ群主要分布在桂南地区。 相似文献