鲤细胞因子多克隆抗体的制备及检测

为从蛋白质水平研究细胞因子在鲤体内免疫应答过程中的合成变化,本研究采用PCR技术克隆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β基因含有部分抗原决定簇的片段,引入双酶切位点Bam HⅠ和HindⅢ后连接至p ET-32a/21a,构建相应的表达载体,制备多克隆抗体。采用ELISA检测抗体效价,并以此作为实验工具,检测经嗜水气单胞菌感染后鲤血清中炎性细胞因子的合成变化。结果显示,基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β融合蛋白分子量分别约为31.8、31.7、35.3、32.5、18.0和33.6 ku;抗体效价达到2.4×106;在病原菌感染后的不同阶段,促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎细胞因子IL-10、TGF-β呈现出不同的合成变化。研究表明,制备的抗体具有较高的效价、亲和力和特异性,可用于鲤细胞因子的定量研究,该抗体的获得为鲤免疫应答与细胞因子合成的系统研究奠定了基础。同时,获取的鲤细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β的抗体亦可用于其他鱼类细胞因子蛋白质水平的定量研究。     

淇河鲫不同组织器官溶菌酶与抑菌活性比较

选择天然三倍体淇河鲫(Carassius auratus in Qihe River),通过试验研究其不同组织器官溶菌酶和抑菌活性,以了解淇河鲫不同组织器官的抗菌能力。结果表明,淇河鲫不同组织器官溶菌酶和抑菌活性存在差异,溶菌酶活性测定值依次为:肝胰脏肾脏鳃脑肠脾脏;抑菌活性测定值依次为:肝胰脏肾脏脑鳃肠脾脏(P0.01);淇河鲫抗菌活性较高的组织为肝胰脏和肾脏,且肝胰脏又极显著高于肾脏(P0.01),肾脏和鳃的抗菌能力极显著高于脾脏(P0.01);表明鱼类不同组织器官免疫能力和抗菌活性存在差异,这种差异与组织器官的生理功能和抗病响应机制不同有关;同时说明鱼类不同组织器官在致病菌干预过程中将发挥不同的作用。     

淡水鱼类对低氧的抗氧化防护响应

正氧气对需氧生物的生存至关重要。同一分压下,水中氧含量仅为陆地空气氧含量的1/30,水生脊椎动物氧的可利用性比陆生动物更重要。此外,氧气在水中的扩散速度只有空气中的1/10 000[1]。所以,无论是生物或非生物过程中引起氧的可利用性或氧消耗变化,均显著影响水环境中溶解氧的含量变化。因此,大多数海洋、河口和淡水较容易发生连续或慢性的低氧现象。低温下淡水水体表面     

乳酸乳球菌Q-9胞外多糖对鲤先天免疫应答、抗氧化活性和抗病性能的影响

为研究乳酸乳球菌Q-9胞外多糖(exopolysaccharides from Lactococcus lactis Q-9, EPS-9)对鲤免疫应答、抗氧化活性以及抗嗜水气单胞菌性能的影响,实验将提取并纯化的EPS-9 (250、500和1 000μg/mL)与鲤头肾细胞体外共培养,检测头肾细胞的增殖能力和吞噬活性,以及孵育液中一氧化氮(NO)和细胞因子的合成量。将300尾健康鲤[(47.66±0.43) g]随机分为5组,对照组(阴性和阳性)灌喂无菌的磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS),处理组分别灌喂不同浓度的EPS-9 (250、500和1 000μg/mL),1次/天,连续处理7 d后取血液和肝胰腺组织。随后,阳性组和处理组腹腔注射嗜水气单胞菌,阴性组用无菌PBS处理,感染24 h后取血液和肝胰腺组织。分别检测血清中NO和细胞因子的合成量,及溶菌酶(LZM)和碱性磷酸酶(AKP)的活性;肝胰腺组织中的抗氧化(T-AOC、T-SOD、CAT、GSH、GSH-Px和MDA)指标。体外结果显示,EPS-9能显著增强鲤头肾细胞的增殖能力和吞噬活性,并提高NO、促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)和抗炎细胞因子(IL-10和TGF-β)的合成量。体内结果显示,与阴性对照组相比,EPS-9灌喂处理能显著上调血清中NO和促炎细胞因子的合成量,LZM和AKP活性,以及肝胰腺的抗氧化水平。嗜水气单胞菌感染后,NO、促炎细胞因子的合成量及LZM、AKP的活性均显著低于阳性对照组。但无论感染与否,EPS-9处理组血清中抗炎细胞因子的合成量均显著升高。研究表明,EPS-9在体内和体外均具备提高鲤的非特异性免疫、抗氧化活性和抗病原菌感染的能力,可作为一种安全有效的添加剂应用于水产养殖。     

不同强度超声波辅助浸浴法导入草鱼嗜水气单胞菌疫苗免疫效果评价

采用不同强度的超声波处理,研究鱼类免疫效应和疫苗导入效果,从而优化最适超声波处理强度,以便应用于渔业实践中。本研究中,在56kHz的超声频率下,采用不同超声强度(0、83、166、250、333mW/cm2),用以辅助浸浴法导入草鱼嗜水气单胞菌疫苗。结果显示,用166、250mW/cm2的超声波强度,免疫14d后,超声处理组溶菌酶活性和白细胞吞噬活性最高,显著高于对照组(P0.05);免疫28d后,血清凝集效价达到最高,显著高于对照组(P0.05)。超声波强度为166、250mW/cm2时,超声波处理组的相对免疫保护率高于对照组和其他处理组,分别达到66.5%和83.5%。本研究表明,用166mW/cm2和250mW/cm2的超声波强度处理后,鱼体免疫效价显著提高,表明该强度可作为适宜的超声波处理强度。实际生产中可采用166~250mW/cm2超声波强度处理,以辅助浸浴法有效导入草鱼细菌性疫苗,研究结果对于渔业生产应用和示范推广将提供重要指导。     

低氧环境下poly I:C刺激对淇河鲫肝胰脏抗氧化防护的影响

明确低氧环境下poly I:C刺激对淇河鲫抗氧化水平的影响,对于理解低氧环境下鱼类对病原类似物的应激反应及免疫能力具有重要的意义。本实验选择体质量为(23±2)g,体长为(11±1)cm的健康淇河鲫,不同溶解氧含量[(1.0±0.2)、(2.0±0.2)、(4.0±0.2)和(6.0±0.2)mg/L)]下饲养7 d后,实验组每尾鱼腹腔注射2 mg/m L poly I:C 100μL,对照组每尾注射0.75%Na Cl溶液100μL,分别在注射后12、24、48、96和168 h时测定肝胰脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性;分析Cu/ZnSOD、Mn-SOD、CAT和GPx基因的m RNA表达变化,同时检测丙二醛(MDA)含量。结果显示,低氧暴露7 d后,亚低氧水平(DO 4 mg/L)时淇河鲫肝胰脏抗氧化酶活性和m RNA表达量均显著高于正常溶氧组6 mg/L,说明在亚低氧条件下,淇河鲫通过抗氧化酶活性增加,在一定程度上降低了低氧的不利影响。低氧(DO 1和2 mg/L)时,抗氧化酶活性和m RNA表达量均显著低于6 mg/L,显示低氧条件下淇河鲫肝胰脏抗氧化防护能力降低,脂质过氧化产物MDA含量随着溶解氧含量的降低而升高。低氧环境下利用poly I:C刺激鱼体,抗氧化酶活性和m RNA表达量在48、96和168 h时显著低于对照组,显示低氧环境下病原类似物poly I:C刺激进一步加剧了鱼体抗氧化防护能力的下降,从而导致严重的氧化应激胁迫。注射poly I:C后MDA的含量显著高于对照组,说明低氧条件下注射poly I:C加剧了淇河鲫肝胰脏氧化应激程度。研究表明,低氧环境下鱼类抗氧化防护能力下降,产生氧化应激胁迫;低氧环境下病原类似物poly I:C刺激可加剧鱼体抗氧化防护水平的下降,从而减弱对外界病原的防御能力。     

黄芪多糖对淇河鲫生长性能、抗氧化功能及抗病力的影响

将淇河鲫(Carassius auratus)随机分为 4 组, 分别以普通饲料、黄芪多糖添加量为 500 mg/kg、1000 mg/kg、 1500 mg/kg 的饲料进行投喂, 42 d 后检测其生长性能、脏器指数和肝脏抗氧化酶活性(总超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)及嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒后淇河鲫的存活率。实验结果显示, 不同剂量的黄芪多糖可显著(P＜0.05)增加淇河鲫增重率和特定生长率; 黄芪多糖添加后淇河鲫肾脏指数和脾脏指数无变化, 仅 1000 mg/kg 黄芪多糖添加组肝脏指数显著高于对照组(P＜0.05); 黄芪多糖能显著增加淇河鲫肝脏 SOD、 CAT 和 GPx 活性, 降低肝脏 MDA 含量(P＜0.05); 不同剂量黄芪多糖添加后均可提高淇河鲫在嗜水气单胞菌攻毒后的存活率, 且 1000 mg/kg 添加组抗菌效果最好, 96 h 后淇河鲫存活率为 75%。上述结果表明, 黄芪多糖可促进淇河鲫生长, 增强其抗氧化能力, 从而提高其抵御细菌感染的抗病力。综合分析和评估, 在水产养殖淇河鲫幼鱼饲料中黄芪多糖适宜添加量为 1000 mg/kg, 可有效防控鱼类感染嗜水气单胞菌疾病的发生。