柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位

【目的】对羊口疮病毒(Orf virus, ORFV)ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究。【方法】使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL对ORFV114蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷(cytarabine, Arac)存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染HEK293细胞,通过Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色...     

南荻炭与镉钝化剂互作对水稻镉含量和产量的影响

为探索一种具有降镉效应的南荻炭基土壤调理剂以缓解湖南省稻田镉污染现状,并为洞庭湖区南荻资源的利用提供新途径。试验以深两优5814为材料,将南荻炭与五种镉钝化剂按L25(56)正交表进行复配,通过模拟镉污染土壤盆栽试验,研究各复配因素施用对水稻镉含量的影响,进而确定南荻炭基降镉土壤调理剂的最佳配伍。结果表明:南荻炭与五种镉钝化剂互作可显著降低(P0.05)水稻茎叶和稻谷籽粒的镉含量,尤其以南荻炭∶腐植酸∶硅酸钾∶钙镁磷∶硫酸锌∶熟石灰=200∶60∶3∶30∶4∶120互作比例下效果最显著,且相应最佳施用量为6.25 t·hm~(-2)。三组最接近理论配比的土调剂施用后,水稻植株的平均镉含量可降至0.88~1.65mg·kg~(-1),与空白处理相比,降镉率达54.4%~75.7%;籽粒的平均镉含量可降至0.13~0.17 mg·kg~(-1),降镉率为45.2%~58.1%。三组土调剂施用还可显著增加稻谷产量,其中最高增产率达34.8%(相当于1.89 t·hm~(-2))。南荻炭与镉钝化剂互作可优化南荻炭的降镉潜力,复配施用后能显著降低水稻镉含量,并能显著提高稻谷产量,具有广阔的市场开发利用潜力。     

柑橘溃疡病相关基因CsPGIP的克隆与表达

【目的】克隆CsPGIP并分析其表达特性,转化柑橘得到超表达转基因株系,并进行柑橘溃疡病抗性评价,为柑橘溃疡病分子育种提供理论依据。【方法】从晚锦橙和四季橘中克隆柑橘CsPGIP,使用MEGA6进行多序列比对并构建系统发育树;采用在线软件BaCelLo和SignalP 4.0进行亚细胞定位和信号肽预测并用GFP瞬时表达确定CsPGIP在细胞内的定位;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种溃疡病菌前后高感品种和高抗品种中柑橘CsPGIP的表达特性,分析溃疡病菌侵染与CsPGIP表达的相关性;农杆菌介导遗传转化晚锦橙,采用GUS染色初筛、PCR鉴定和qRT-PCR相结合的方法鉴定超表达转基因株系;观察转基因和野生型株系表型变化,分析其株高、叶片表型;离体针刺法对超表达转基因株系和野生型株系进行柑橘溃疡病抗性评价,统计病斑面积和病情指数,分析CsPGIP表达对柑橘抗、感溃疡病的影响。【结果】晚锦橙和四季橘CsPGIP均编码328个氨基酸,与已报道的柑橘中的PGIP同源性高达99.39%,都包含2个PGIP基因典型的LRR结构域（LRR_1和LRR_2）;构建系统进化树发现甜橙中的CsPGIP与葡萄中的PGIP（GSVIVT01033370001）遗传距离最近,相似度达到62.97%,推测CsPGIP与葡萄中的PGIP具有类似的抗病效果。亚细胞定位和信号肽预测结果表明CsPGIP属于分泌蛋白,GFP洋葱瞬时表达证明柑橘CsPGIP定位在细胞膜和细胞壁,与预测结果一致。高感品种晚锦橙和高抗品种四季橘接种溃疡病菌后CsPGIP的表达特性不同,在高感品种中表达显著下调,而高抗品种中表达显著上调且维持在较高水平,推测CsPGIP与柑橘溃疡病的抗性相关。构建CsPGIP超表达载体并转化晚锦橙,通过PCR鉴定和qRT-PCR确定其中9个（OE1、OE3、OE4、OE5、OE6、OE9、OE10、OE12和OE14）为CsPGIP超表达阳性株系。通过对转基因株系的表型观察发现OE3、OE14株系表型与野生型株系相比差异明显,植株表现为较矮小,其中OE14出现叶片卷曲、增厚的表型变化。对CsPGIP超表达转基因株系（8个株系）进行离体抗溃疡病评价,结果显示超表达转基因株系可以使柑橘溃疡病病斑面积降至野生型的24.11%—83.88%,其中OE1株系的病斑面积最小;从病情指数来看,除OE3株系外,其余株系的病情指数均比野生型显著下降（为野生型的23.12%—75.49%）,其中OE1下降最显著,综上结果可知超表达CsPGIP可以有效抑制柑橘溃疡病菌的生长。【结论】CsPGIP是柑橘响应溃疡病菌侵染的重要基因,可抑制或减轻柑橘溃疡病的发病程度,在柑橘抗溃疡病机理研究方面具有较大的应用价值,也可作为柑橘抗溃疡病分子育种的一个候选基因。     

超量表达CsGH3.6通过抑制生长素信号转导 增强柑橘溃疡病抗性

背景 由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起的柑橘溃疡病是柑橘生产上最具毁灭性的一种病害。植物生长素在调控柑橘溃疡病菌引起的寄主侵染部位脓疱形成中起重要作用。生长素早期响应基因GH3通过酰基化吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）调控植物激素动态平衡。前期研究发现柑橘CsGH3.6在调控生长素响应溃疡病侵染中起着重要作用。目的 通过对超量表达CsGH3.6转基因晚锦橙的抗病性、植株表型、细胞和激素变化进行分析,利用RNA-Seq解析CsGH3.6调控的信号通路,探明CsGH3.6调控激素动态平衡影响柑橘溃疡病抗性的内在机制。方法 利用针刺法对离体转基因叶片接种溃疡病菌Xcc,统计接种第10 天时病斑面积和病情指数,以野生型为对照,评价转基因植株的抗性水平;提取感病前后叶片内源激素,利用高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography,HPLC )检测转基因植株中激素含量变化;温室中观察转基因植株表型变化;通过测量叶片纵径、横径和厚度分析转基因植株叶型变化特征;制备叶片表皮切片,显微观察表皮细胞和气孔,并统计转基因植株表皮细胞长度和气孔密度;采用RNA-Seq测序技术研究转基因植株转录组变化情况,并利用Nr、Nt、Pfam、COG、SwissProt和gene ontology (GO)数据库注释基因功能,进一步利用KEEG数据库和MapMan软件解析超量表达CsGH3.6影响的重要基因、功能和途径,阐明CsGH3.6调控柑橘溃疡病抗性的分子机制。结果 超量表达CsGH3.6显著增强转基因植株的溃疡病抗性;转基因植株分枝增多且下垂,叶片向上卷曲,变小,颜色浅;转基因植株气孔密度增加,表皮细胞变短;激素含量分析显示,转基因植株自由生长素（IAA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）含量显著降低,而水杨酸（salicylic acid,SA）含量显著增加;转录组测序分析表明,超量表达CsGH3.6显著抑制生长素信号转导相关基因表达,特别是所有注释的Aux/IAA家族基因均下调表达,相反,与生物胁迫相关基因的表达为上调,其中绝大部分基因为病程相关蛋白基因。结论 超量表达CsGH3.6通过酰基化自由IAA抑制生长素信号转导,调控JA和SA的动态平衡,改变细胞和植株的形态建成,从而增强柑橘对溃疡病的抗性。研究结果暗示调控激素动态平衡在柑橘抗病育种中具有潜在价值。     

转录因子CsWRKY61对柑橘溃疡病抗性的影响

【背景】柑橘溃疡病（citrus bacterial canker,CBC）是世界柑橘产业上危害最严重的病害之一,由柑橘黄单胞杆菌柑橘亚种（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）引起,在国内外被列为检疫对象。由于柑橘分子病理研究相对滞后,导致可供利用的抗性基因资源相对匮乏。WRKY转录因子参与植物抵御生物和非生物胁迫反应,前期研究发现柑橘WRKY转录因子可能在调控寄主抗病反应中起着重要作用。【目的】通过对超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72转基因晚锦橙（Citrus sinensis）的溃疡病抗性进行评价,明确这些基因在柑橘响应溃疡病菌侵染中的生物学功能和抗病育种价值。进一步利用RNA-Seq解析CsWRKY61调控的信号通路。【方法】利用农杆菌介导法进行柑橘遗传转化,获得超量表达CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72的晚锦橙;利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析转基因植株中目的基因的表达水平以及拷贝数;以非转基因植株为对照,采用离体针刺接种评价转基因植株对溃疡病的抗性;通过比较超量表达CsWRKY61和野生型植株的转录组测序结果,探究CsWRKY61提高柑橘溃疡病抗性的内在机制。【结果】分别构建了CAMV 35S启动子控制CsWRKY50、CsWRKY61和CsWRKY72表达的植物表达载体,通过GUS组织化学染色和PCR鉴定分别获得了6、8和6株转基因晚锦橙。转基因植株中目的基因的表达量有不同程度的提高,大部分转基因植株中外源基因的拷贝数为1,只有超量表达CsWRKY61的转基因植株溃疡病抗性显著增强,其病斑面积明显小于野生型植株,而超量表达CsWRKY50和CsWRKY72的转基因植株抗病性与野生型相比无明显差异。转录组分析结果显示,超量表达CsWRKY61的转基因植株中生物胁迫相关途径（包括病原入侵的感知、活性氧爆发、转录因子、防御基因、激素、细胞壁和次生代谢等）和信号转导相关途径（主要是激酶受体）均被显著激活。【结论】超量表达CsWRKY61能够激活与生物胁迫和信号转导相关的途径,增强柑橘对溃疡病的抗性;CsWRKY61在柑橘抗病育种中存在潜在的应用价值。     

溃疡病菌侵染早期柑橘细胞程序性死亡的响应特征及机制

为进一步研究柑橘溃疡病抗性与细胞程序性死亡的关系， 以高感品种晚锦橙（甜橙类，Citrus sinensis Osbeck）和高抗品种金弹（金柑类，Fortunella crassifolia Swingle）为试材，从抗性特征、发病早期的相关信号变化、抗氧化酶活性和基因表达变化等方面探讨柑橘细胞程序性死亡响应溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri）侵染的特征及机制。接种溃疡病菌后，晚锦橙叶片出现明显的海绵状凸起，为典型的溃疡病症状；而金弹则出现超敏化反应细胞坏死症状。接种前，过氧化氢（H2O2）在金弹中的基础水平较晚锦橙高；接种后，两品种的H2O2含量均上升，但金弹上升幅度高于晚锦橙。随着H2O2水平升高，代表膜脂过氧化程度的丙二醛（MDA）含量在两个品种中均增加，但金弹中增加幅度更大。抗氧化酶系统中的超氧化物歧化酶（SOD）活性在晚锦橙和金弹叶片中均呈下降趋势；过氧化氢酶（CAT）活性在两个品种中均提高且差异不大；过氧化物酶（POD）活性在两个品种中均提高，但晚锦橙的上升更快，且提高程度低于对照。参与细胞程序性死亡正调控的基因CsCEP1-1、CsCEP1-2和CsMCA1在两个品种中均受溃疡病菌诱导上调表达，但金弹中的表达水平显著高于晚锦橙；参与细胞程序性死亡负调控的CsDAD1-1、CsDAD1-2、CsMLO2和CsMLO3的转录水平在晚锦橙中变化不大，而金弹中随着接种时间的延长逐渐降低。结果表明，溃疡病菌胁迫下晚锦橙和金弹在发病早期均启动了超敏化反应，但在金弹中更为强烈，有助于诱导发生细胞程序性死亡，而限制病原菌的生长，这可能是金弹抗病性强的内在原因之一。     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

柑橘MAPK基因的生物信息及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

为挖掘柑橘溃疡病抗性关键基因，对柑橘促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因家族进行注释和功能域分析，明确了CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4、CsMPK6和CsMPK19的组织表达特异性和在抗病品种‘金弹’（Fortunella japonica Swingle）和感病品种‘晚锦橙’（Citrus sinensis Osbeck）中受病原菌（Xanthomonas citri subsp. citri，Xcc）诱导的表达情况；并对CsMPK19进行了生物信息分析。共注释出12个柑橘MAPK基因家族成员，根据系统发育树将其分为3个亚类，均含有促分裂原活化蛋白激酶（Pkinase）功能结构域。其中CsMPK1、CsMPK3、CsMPK4-1和CsMPK6在果实中表达水平较高，CsMPK19在叶片中表达量相对较高。CsMPK1的表达在溃疡病抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在感病品种中上调的幅度高于抗病品种；CsMPK3 和CsMPK6仅在感病品种中病原菌处理早期有较强烈的响应；CsMPK4-1和CsMPK4-2的表达在感病品种中受病原菌诱导上调，而在抗病品种中病原菌处理后低于水处理对照；CsMPK19的表达在抗（感）品种中均受病原菌强烈诱导，且在抗病品种中上调幅度更大。克隆了CsMPK19，其序列全长为1 824 bp，编码607个氨基酸，分子量为69 174.36 D，为非分泌性蛋白，其25 ~ 316 aa为典型的Pkinase功能域。晚锦橙和金弹MPK19启动子的顺式作用元件存在较大差异。结果表明柑橘MAPK基因强烈响应溃疡病菌侵染，推测CsMPK19在溃疡病抗性调节中有潜在应用价值。     

柑橘AOS1-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

对柑橘中茉莉酸（Jasmonic acid,JA）生物合成途径中的关键限速酶丙二烯氧化物合酶AOS家族基因进行注释,确定其受溃疡病菌Xanthomonas citri subsp. citri(Xcc)诱导的表达模式。从甜橙数据库中共注释出3个AOS家族成员,其中CsAOS1-2对溃疡病菌响应最强烈;CsAOS1-2在‘晚锦橙’（甜橙,易感溃疡病）和‘金弹’（金柑,抗溃疡病）中均受病原菌诱导,但在‘晚锦橙’中表达量上调幅度远高于金弹;CsAOS1-2全长2 656 bp,开放阅读框1 599 bp,编码532个氨基酸,分子量为59 499.81,为非分泌性蛋白,其349～510 aa为典型的P450功能域;Cs AOS1-2的表达无组织特异性;‘晚锦橙’和‘金弹’的AOS1-2启动子均含有参与植物激素和逆境应答的顺式作用元件,但在数量和类型上存在差异;烟草瞬时转化亚细胞定位分析显示CsAOS1-2定位在叶绿体中。CsAOS1-2强烈响应柑橘溃疡病菌的侵染,推测其与柑橘溃疡病敏感性具有密切的关系。