人泛素基因原核表达载体构建、表达及鉴定

[目的]构建含人泛素(Ubiquitin,Ub)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]应用PCR扩增人Ub基因片段,插入表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)PLysS,经诱导表达及鉴定。[结果]PCR扩增出约228bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约34000,纯化后鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人Ub蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

中国肝细胞癌p53基因热点突变R249S的载体构建及其在细胞中的表达

抑癌基因p53突变是人肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）中常见的现象，中国江苏启东地区的HCC患者中p53基因的第249位密码子突变AGG→AGT/Arg→Ser（R249S）被认为是热点突变。本研究以人肝cDNA为模板，扩增人全长p53基因，将其克隆到pCMV-Myc载体中。利用定点突变引物以pC-MV-p53为模板，构建R249S定点突变体pCMV-R249S，转染p53缺陷型的H1299细胞系。Western Blot检测表明，克隆在pCMV-Myc载体中的p53基因和249位密码子热点突变的p53基因都可以在H1299细胞系中表达。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

中国肝癌病人p53突变体R248W的细胞功能研究

【目的】探索p53基因突变对细胞正常功能的影响,阐明肝癌的发病机制。【方法】利用PCR产物直接测序的方法,对202例中国肝癌患者p53基因的11个外显子进行突变筛查;利用定点突变的方法构建真核表达载体pCMV-R248W,Western blot检测突变体蛋白R248W在p53缺失型H1299细胞中的表达情况;采用双荧光素酶报告基因检测系统和流式细胞仪,研究R248W突变对转录活性及促凋亡能力的影响。【结果】在其中1例样本的7号外显子处筛查到突变形式为CGG→TGG的点突变,使p53蛋白248位的精氨酸(Arg)突变为色氨酸(Trp),即R248W,突变率为0.495%;在H1299细胞中转染等量的pCMV-p53和pCMV-R248W时,野生型p53与突变体R248W的蛋白表达量相当,但R248W的转录活性及促凋亡能力显著低于野生型p53。【结论】R248W突变可能引起p53蛋白构象的改变,从而影响p53的转录活性及促凋亡能力,使细胞的正常生理功能紊乱,导致肿瘤发生。     

通用型基因打靶载体的构建及其功能鉴定

利用DNA同源重组(基因打靶)技术对动物基因组进行遗传修饰是转基因研究的重要手段之一。本研究以pEGFP-C1载体为载体骨架,成功构建了包含两个多克隆位点、两个同向LoxP(locus of crossing-over(x)in P1)序列和正负筛选标记基因的通用型打靶载体pGT-C1。正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因(Neo)和水母绿色荧光蛋白基因(AcGFP)在两个LoxP序列之间;负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk和两个多克隆位点序列分别在两个LoxP序列外侧。经双酶切和测序证明载体构建成功后,转染胎牛成纤维(fetal bovine fibroblast,FBF)细胞,利用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GANC)分别对正负筛选标记进行功能验证;随后将Cre重组酶表达载体转染阳性FBF细胞,用半定量PCR检测Cre-LoxP系统的切割效率;最后构建针对牛(Bos taurus)β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并在转染药筛后对其打靶功能进行检测。打靶载体pGT-C1具有以下优点:包含两个多克隆位点,方便长短同源臂的定向插入,极大提高了该载体的通用性;位于两个同向LoxP之间的绿色荧光标记基因AcGFP可实时监控载体的转染效率和整合效率,还能依据荧光表达筛选去除筛选标记的阳性细胞,降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响,为高效基因打靶提供了保证。综上所述,本研究成功构建了更加实用、有效的通用型打靶载体pGT-C1,以及针对牛β酪蛋白质基因的打靶载体pGT-L-R,并成功获得了转基因牛成纤维细胞单克隆,为转基因动物模型的建立提供了基础工具。     

毛细管电泳分离DNA片段的研究

应用毛细管无胶筛分电泳，对DNA的酶切片段的分离进行了研究。结果表明在0.5%羟基丙基甲基纤维素和1μg/ml溴化乙锭存在的条件下，11条DNA片段被基线分离，保留时间的RSD小于0.1%(n=4)。结合样品在线浓缩技术，进样90s仍然能够获得极高的分辨率。     

小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2磷酸化的变化

通过Western杂交检测了小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2的磷酸化变化情况。用抗p34^cdc2C末端抗体的杂交结果显示，小鼠卵母细胞体外成熟过程中p34^cdc2表现为上、中、下三条带，其中中带在培养4h出现，并持续增加直到培养16h,在20h有一个下降趋势并在培养24h又回升；上带从0－16h表现为持续下降趋势，20h稍回升后24h又下降；下带在整个培养过程中表现平稳。用特异性识别p34^cdc2去磷酸化的Tyr-15和Thr-14的抗p34^cdc2N末端抗体杂交结果，证明中带为p34^cdc2在Tyr-15和Thr-14上去磷酸化的形式。     

电解质平衡值对热应激时肉鸡生产性能和血液生化指标的影响

研究表明,在热应激状态下饲喂DEB240 mEq/kg饲料,肉鸡的抗热应激效果较好,能有效缓解酸碱失衡,血液中离子常数值变化较小,肉鸡达到气喘和虚脱的时间较长。     

人SUMO1基因的真核表达载体构建及其RNA干扰靶点筛选

[目的]构建人SUMO1的真核表达载体,筛选SUMO1的有效干涉靶点。[方法]将SUMO1亚克隆至载体pCMV-HA中。寻找可能的干涉位点,合成上下游引物,退火后直接克隆入GFP-HU双启动子载体。用WesternBlot和细胞荧光的方法检测各载体对外源性SUMO融合蛋白表达的影响,其后检测对内源性SUMO1表达的敲降效果。[结果]构建的人SUMO1真核表达载体pCMV-HA-SUMO1测序正确。针对267、279、293、309、342、386等不同干涉靶点构建双启动子干扰载体,其中293位点的干涉载体在WesternBlot和荧光检测试验中均表现出稳定的敲降效果,抑制了SUMO1的表达。[结论]该研究成功构建了SUMO1的真核表达载体及具有明显敲降效果的干涉载体,可为后续研究奠定基础。