羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析

【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性.     

塞内卡病毒A结构蛋白VP1诱导PK-15细胞凋亡

塞内卡病毒A(SVA)作为一种新发病病原,致病机制仍不清楚。通过显微镜观察发现,SVA感染PK-15细胞后能使细胞产生明显的细胞病变(CPE),同时伴随着严重的细胞凋亡。为了深入研究SVA诱导凋亡的情况,在验证SVA各蛋白真核质粒正常表达后,通过Annexin V-FITC/PI双染流式方法检测SVA各蛋白诱导凋亡的情况,Annexin V-FITC/PI和Hoechst染色后显微镜观察磷脂酰丝氨酸和核凝聚程度,通过Western blotting和RT-PCR技术分析SVA-VP1对凋亡通路中主要调控分子Caspase3、Caspase8和Bax蛋白质和mRNA水平的影响,发现SVA-VP1能够显著诱导细胞发生早期和晚期凋亡,并且能够促进凋亡蛋白Caspase3、Caspase8及Bax蛋白和mRNA水平的上调。本研究结果为深入研究SVA调控宿主细胞凋亡的分子机制和致病机制奠定了理论基础。     

猪源DDX56对口蹄疫病毒的复制及其对病毒诱导的RLR通路调节的研究

DEAD框解旋酶56(DDX56)是一种RNA解旋酶,能参与RNA代谢和核糖体的合成。为研究猪源DDX56对口蹄疫病毒(FMDV)复制和对病毒诱导的RLR通路的影响,首先通过免疫共沉淀试验筛选与猪源DDX56互作的FMDV蛋白;接着利用Q-PCR和Western blot检测过表达猪源DDX56对FMDV在PK-15细胞中复制的影响;然后利用双荧光素酶报告基因和Q-PCR检测猪源DDX56对病毒诱导的RLR通路的影响。结果显示,猪源DDX56能与FMDV蛋白VP0、VP1、VP2和3A发生相互作用;过表达猪源DDX56能够促进FMDV的复制;过表达猪源DDX56能抑制仙台病毒(SeV)诱导的RLR通路的激活;猪源DDX56可以协同FMDV蛋白VP0、VP1、VP2和3A抑制病毒诱导的Ⅰ型干扰素的产生。总之,猪源DDX56能与FMDV蛋白VP0、VP1、VP2和3A互作而协同抑制Ⅰ型干扰素的产生,从而促进FMDV的复制。     

Gα12蛋白抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞上复制

鸟嘌呤核苷酸结合蛋白Gα12参与多种细胞反应的调节,但是在口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）方面的研究较少。本研究中,用FMDV感染PK-15细胞,发现Gα12的mRNA和蛋白水平都有所上调,预示Gα12可能与FMDV复制存在某种联系,需要进一步研究Gα12蛋白对FMDV在PK-15细胞上复制的影响。为此,在过表达Gα12和干扰Gα12表达的情况下,通过实时荧光定量、Western blot和TCID₅₀检测Gα12对FMDV复制的影响。结果表明,过表达Gα12后,FMDV的mRNA水平、蛋白水平和病毒滴度都有所降低,然而,下调Gα12后,FMDV的复制呈相反的趋势,说明Gα12可以抑制FMDV在PK-15细胞上的复制。本研究首次发现Gα12具有抑制口蹄疫病毒复制的作用,为抗FMDV的研究提供了新思路和理论基础,对FMDV相关研究具有重要意义。     

程序性细胞死亡因子10抑制Ⅰ型干扰素表达并促进FMDV复制

旨在探究宿主蛋白程序性细胞死亡因子10(programmed cell death factor 10,PDCD10)通过抑制Ⅰ型干扰素表达进而促进口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)的复制.首先,本研究验证了过表达和沉默PD-CD10对FMDV复制的影响,接着利用双荧光素酶...     

口蹄疫及其防控技术

一、口蹄疫简介人类对口蹄疫(FMD)第一次较为确切的记载出现于1514年。17～18世纪欧洲曾多次流行FMD,1839年传入英国,但直至1880年FMD泛滥成灾才引起科学家和官方的注意。此后欧洲经历了漫长的口蹄疫控制与消灭过程,直到1991年才基本上消灭了FMD。期间共有过1901-1912年、1919-1921年、1937-1939年、1950-1952年四次严重流行,而在上个世纪五十年代初最     

猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用

旨在建立猪瘟病毒（CSFV）化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法。该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均无交叉反应;批内变异系数为1.80%~6.88%,批间变异系数为1.11%~9.18%,重复性好。通过对152份田间猪血清样品的检测并与商品化CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行比较,其Kappa值为0.929,具有高度的一致性。综上表明,本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好、简单快速,可应用于临床血清CSFV抗体的检测。     

高致病性猪蓝耳病病毒GS/LZh/07株的分离、鉴定及其非结构蛋白Nsp2基因特性分析

将高致病性猪蓝耳病疑似病料接种Marc145细胞,发现该病料可使Marc145细胞产生CPE,应用猪蓝耳病病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,命名为Gs/Lzh/07株。同时应用RT-PCR方法扩增该分离毒株的非结构蛋白Nsp2基因,并进行了序列测定,发现所扩增到的Nsp2基因有90个核苷酸的缺失。序列比对结果表明：该分离病毒Nsp2基因与经典毒株PRRSV-ch-1a核苷酸同源性为83.0%,氨基酸同源性为72.7%;与高致病性变异毒株NX和SD核苷酸同源性为95.5%,氨基酸同源性为90.9%,可见该毒来源于2006-2007年流行毒株,说明高致病性猪蓝耳病变异病毒已经在甘肃省存在。该毒株的成功分离为高致病性猪蓝耳病流行病学调查分析提供数据,也为预防控制该病积累了资料。Nsp2的特性分析为揭示高致病性猪蓝耳病PRRSV在甘肃省的流行特点提供参考。     

猪水泡病病毒结构蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和淋巴细胞表位的预测

以免疫信息学和反向疫苗学为理论根据，利用RT-PCR法获得了猪水泡病病毒（SVDV）HK／70株的基因组序列并测序，应用生物信息学相关软件和方法，对SVDV结构蛋白的二级结构的不同方面及其抗原特异性淋巴细胞表位进行了预测，综合评价了SVDV结构蛋白的抗原特异性细胞表位，并计算出一些潜在的抗原位点。结果表明，VP1蛋白含有的细胞优势抗原表位最多，但其他结构蛋白也含有抗原特异性淋巴细胞表位，有的甚至有可能成为优势抗原表位或对优势抗原表位有协同作用。