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猪瘟病毒野毒株TaqMan-MGB荧光定量PCR、鉴别方法的建立与应用 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】建立一种快速、敏感、特异地检测猪瘟病毒野毒的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法,为临床鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒提供了准确可靠的工具。【方法】在猪瘟病毒基因组5′端非编码保守区设计一对猪瘟病毒通用引物和一条特异性MGB探针,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件,进行特异性、灵敏度和临床样本符合检验。【结果】该方法在100~10-7范围内线性相关系数为0.998,检测极限达5.3×10-2pg 病毒核酸;对24个质控样本检测结果显示,该方法能检测除猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)以外的猪瘟流野毒株,其它猪相关致病病原检测阴性;对122份疑似猪瘟样本检测的结果与本实验室建立的RT-nPCR方法的符合率为94.3%(115/122),阳性和阴性符合率分别为86.4%(38/44)和98.7%(77/78),Kappa值为0.87>0.75。【结论】建立的一步TaqMan-MGB 荧光定量PCR方法能鉴别猪瘟野毒和HCLV疫苗毒,且特异性好、灵敏度高、与笔者先前建立的RT-nPCR方法对临床样本的检测结果具有高度的一致性。 相似文献
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RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布 总被引:2,自引:2,他引:0
【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株(HeBHH1/95)为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株(SM)接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示:8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。 相似文献
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猪瘟病毒(CSFV)疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3′-UTR含有一定长度的插入序列。本研究通过反向遗传学操作,构建了3′-UTR含有19nt、32nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3′-UTR插入片段并不影响病毒的拯救。通过3′-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。 相似文献
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采用杆状病毒表达系统表达并纯化猪瘟病毒E^rns蛋白,并对其反应原性进行鉴定。将猪瘟病毒的E^rns 基因克隆至pFastbac-HT-A 载体上,构建了pFA-E^rns重组质粒;经转座、转染后构建重组杆状病毒rBac-E^rns;通过优化接毒时间和接毒量等参数,最终确定表达条件。将表达产物采用亲和层析法纯化后,采用Western Blotting 鉴定E^rns 蛋白的反应性,并采用间接ELISA 方法对其应用进行了初步探索。结果显示,获得了重组杆状病毒rBac-E^rns,经Western Blotting 和间接免疫荧光(IFA)鉴定,该重组病毒能够与猪瘟阳性血清和E^rns 单抗发生特异性反应。纯化后的E^rns 蛋白纯度较好,浓度为0. 2 mg/ mL,经Western Blotting 方法鉴定证明,纯化后的蛋白与E^rns单抗和猪瘟阳性血清能够发生特异性反应;初步建立了间接ELISA 方法检测猪瘟抗体,证明表达的蛋白可以区分猪瘟阳性血清和阴性血清。表明本研究利用杆状病毒表达系统成功表达并纯化了猪瘟病毒E^rns蛋白,纯化后的E^rns蛋白具有良好的反应性,可以作为开发鉴别诊断试剂的备选蛋白以及用于E^rns 蛋白的结构和生物学功能研究。 相似文献
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猪瘟病毒(CSFV)疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3'-UTR含有一定长度的插入序列.本研究通过反向遗传学操作,构建了3'-UTR含有19 nt、32 nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3'-UTR插入片段并不影响病毒的拯救.通过3'-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3'-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一. 相似文献
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猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救 总被引:3,自引:0,他引:3
采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具. 相似文献
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【目的】分析CSFV3′-UTR一级序列和二级结构,为研究其对病毒复制、增殖和毒力的关系奠定良好的基础。【方法】利用RT-PCR技术扩增CSFV Thiverval株、HCLV株和Shimen株的3′-UTR并测序,使用DNAstar、Sequencher和RNAstructure软件进行CSFV3′-UTR基因组序列的比对分析和二级结构模拟。【结果】Thiverval株3′-UTR最长可达259个碱基,与母源株Alfort相比,含有32nt的插入,最短只有233个碱基,含有6nt的插入。HCLV株最长有244个碱基,含有17nt的插入;最短有233个碱基,含有8nt的插入。同时,疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型和自由能发生改变,自由能随着插入片段的增加而升高。【结论】(1)CSFV3′-UTR存在两个高度变异的区域。(2)CSFV疫苗株Thiverval株和HCLV株3′-UTR同一样品不同克隆株中插入片段呈现明显的不均一。(3)疫苗株的插入片段影响3′-UTR二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。 相似文献