尾叶桉GLU4肉桂酰-辅酶A还原酶基因克隆及原核表达

肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对EuCCR进行原核表达,重组质粒成功表达分子量约36 kD的目的蛋白。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

毛白杨木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶PtoXTH35原核可溶性表达方法研究

从毛白杨中克隆得到木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶PtoXTH35基因,根据SignalIP在线软件预测蛋白信号肽,并分别构建至pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a等5种原核表达载体,经双酶切和测序验证后转化至BL21(DE3)感受态,使用终浓度为0.4 mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导其表达目的蛋白。经SDS-PAGE检测,结果表明5种载体均可表达目的蛋白,pET28a、pET32a、pGEX-4t-1等3种载体所表达蛋白均以包涵体的形式存在,而pMAL-c5e和pET 43.1a载体携带蛋白表达量高并且所表达蛋白50%为可溶性蛋白,实现了毛白杨PtoXTH35在原核表达系统中的高效可溶性表达,该试验为后续进一步研究毛白杨PtoXTH35的体外功能奠定了基础。     

一种改进的双色SDS-PAGE凝胶和可视化上样电泳方法

SDS-PAGE电泳是蛋白质分析和研究中的重要高效手段．由于分离胶、浓缩胶与电泳缓冲液以及空气都是无色透明的物质,在胶的制作和点样过程中仅仅通过浓缩胶相与缓冲液水相或空气相对光的折射来准确判断点样孔的位置并进行点样操作,因而比较困难．该文介绍1种在浓缩胶中添加颜色染料,使浓缩胶显现颜色,以此可视化区分浓缩胶中点样孔（井）位置的方法,可以准确而高效完成点样操作,使传统的SDS-PAGE点样过程通过折光性来判断变为可视化准确判断,提高点样效率和电泳质量．      

杨树肉桂醇脱氢酶基因序列和表达模式分析及CAD4酶活性检测

应用生物信息学方法从杨树基因组数据库中筛选出19个杨树肉桂醇脱氢酶基因,它们聚为3类.序列分析表明,杨树CAD基因家族主要通过全基因组加倍和串联复制的方式进行扩张.杨树和拟南芥CAD家族共6对旁系同源基因,在较强的净化选择压力下进化.19个基因在杨树不同组织中均有表达,表达量较高的是PoptrCAD17、PoptrCA...     

HPLC-MS/MS检测杜仲中绿原酸等4种活性成分的分析方法

杜仲作为一种传统的中药材,其活性成分主要包括绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸等。本研究建立了一种HPLC-MS/MS(高效液相色谱质谱联用仪)检测的方法,可同时检测杜仲中桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸和绿原酸的含量。建立的色谱条件:色谱柱XD-C18,流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇,流速0.15mL/min,柱温30℃。质谱条件: ESI离子源作为裂解源,裂解温度280℃,源内电压4kV,鞘气辅助气为氮气,流速30psi,雾化气为氦气,流速10psi。结果表明:4种目标化合物的色谱峰分离情况良好,质谱鉴定为目标物;绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷和京尼平苷酸标准曲线的相关性系数分别为0.9935、0.9942、0.9969、0.9948;最低检测限的范围是7.603~8.853pmol;加样回收率范围是91.838%~108.326%。测定得到杜仲叶中桃叶珊瑚苷的含量为(20.552±4.032)ng/mg干质量,京尼平苷酸含量为(6.913±0.654)ng/mg干质量,绿原酸含量为(25.986±3.412)ng/mg干质量,京尼平苷含量为(0.205±0.015 )ng/mg干质量。利用该方法在7种植物组织中进行方法验证,测定得到4种目标化合物的含量,表明本方法有效且适用性广。      

适用于毛白杨芽双向电泳分析的蛋白质提取方法

本实验以毛白杨芽为实验材料,采用Tris鄄酚法、三氯乙酸/ 丙酮法和三氯乙酸/ 丙酮+ Tris鄄酚法对其蛋白质提 取方法进行比较,采用双向电泳分离蛋白质,通过PDQuest 软件和质谱对这3 种提取方法得到的双向电泳胶进行分 析。结果显示,三氯乙酸/ 丙酮法得到的蛋白点数量为231 ±4,得到的鲜样中的总蛋白质含量为(3.57 ±0.618) mg/ g,均高于其他两种提取方法,并且所得到的双向电泳胶更清晰,为毛白杨芽蛋白质提取的最适方法。      

毛白杨木质素合成酶基因F5H克隆与生物信息学分析

克隆毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)基因全长序列,并通过生物信息学分析,为进一步研究F5H基因功能提供基础.利用RT-PCR方法成功从毛白杨741组培苗叶片中克隆了F5H基因,并对F5H基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,包括疏水性-亲水性、氨基酸翻译后修饰、亚细胞定位、跨膜结构域、蛋白质二级三级功能结构域等进行分析预测和推断.获得的基因长度为l 686 bp,编码区1542 bp,与已公布的毛果杨F5H mRNA序列(GenBank登录号为AJ010324)的编码区相似性达97.45％,并与其他植物的该基因序列具有同源性.F5H是亲水性较强的蛋白,整条肽链有1个跨膜结构域;通过亚细胞定位表明F5H主要位于质体中,并含有磷酸化位点有19个.F5H含有丰富的二级结构,卷曲占44.44％、折叠占7.02％、螺旋占48.54％,并预测了其三维结构.分析结果显示,植物的阿魏酸-5-羟基化酶是一个具有跨膜结构域的亲水性蛋白,在内质网等分泌途径中表达.     

双向启动子构建及在毛白杨中瞬时表达研究

该研究通过PCR扩增、酶切及连接等分子生物学研究方法分别将β葡萄糖苷酶基因(gusA)和绿色荧光蛋白基因(gfp)与双向启动子两端融合,构建成双可视报告基因融合双向启动子的植物二元表达载体pBDGG. 通过农杆菌介导的叶盘法转化毛白杨叶片以鉴定所构建的双向启动子的功能. 对农杆菌侵染3～4 d的毛白杨同一叶片进行GUS组织化学染色检测和紫外激发后通过荧光显微镜观测绿色荧光,结果表明gusA基因和gfp基因都能够进行瞬时表达,表明该双向启动子可在毛白杨中实现双向表达. 该文还讨论了双向启动子在植物基因工程中应用的可能性,为实现植物基因工程的“一箭双星”（即一个启动子同时双向表达两个或多个基因）奠定基础.      

若干双子叶与单子叶植物细胞壁果胶结构单糖组成特征研究

为了系统研究被子植物初生壁果胶结构单糖的组成成分及其与被子植物两纲分类的关系,结合单糖单一环式的衍生化方法,采用GC/MS测定22种被子植物初生壁果胶中单糖组分及含量,并对测得的结果进行主成分、t检验和香农 威纳指数分析。结果表明:被子植物细胞壁果胶由木糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖7种单糖组成,其中鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖含量较高;岩藻糖和甘露糖含量极少。主成分分析筛选出决定22种被子植物间糖含量差异的5种果胶单糖分别为:木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖。主成分二维图和t检验结果显示:可通过果胶单糖含量实现被子植物中双子叶和单子叶两纲植物的区分,且木糖和半乳糖决定了两纲间的显著性差异（P＜0.01）。同时香农 威纳指数结果显示了被子植物两纲在单糖含量的多样性上也存在差异,且双子叶植物的单糖多样性显著高于单子叶植物（P＜0.01）。      

毛白杨阿魏酸-5-羟基化酶对烟草木质素的影响

为了研究阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)在木质素合成途径中的调控作用,采用CTAB法提取毛白杨RNA,反转录得到cDNA并克隆出毛白杨F5H基因,将其以正义、反义、干涉的基因形式,使用农杆菌侵染法导入烟草基因组中.将得到的转基因植株茎段进行解剖分析,并测定其木质素细胞壁化学组成.转基因植株的木质素、纤维素总量和木质部解剖分析结果与野生型相比均为未表现出明显差异,植株正常生长.F5H的过量表达和基因沉默均不影响植株木质化和生长,可以说明它是木质素合成途径可供选择的一个很好的调控点.