外源ABA处理大麦胚的均一化cDNA文库的构建

构建外源ABA处理大麦胚的均一化cDNA文库是利用酵母双杂交方法筛选与靶蛋白相互作用蛋白的前提条件。为给大麦抗逆基因的研究及抗逆转基因大麦材料的创制奠定基础,利用5μmol·L-1ABA和蒸馏水分别处理大麦种子0h、6h、12h、24h,剥取大麦的胚,用热酚法提取总RNA,利用SMART原理进行反转录PCR并进行均一化处理获得ds-cDNA。经SfiⅠ酶切的ds-cDNA与pGADT7-Rec载体连接后,转化大肠杆菌感受态细胞DH10B构建文库。结果表明,文库的容量为1.1×106,插入片段大于1 000bp,集中在1 000~3 000bp之间,符合酵母双杂交文库的要求。     

转外源Trxs基因大麦耐盐性有关生理生化特性分析

以过量表达硫氧还蛋白s基因(Trxs)的转基因大麦株系(LSY-11-1-1)及其非转基因对照(CK)为试验材料,研究了50mmol/L盐胁迫条件下,Trxs过量表达对大麦幼苗耐盐性有关生理生化特性的影响.结果显示:盐胁迫下转基因大麦的鲜重与干重高于对照,而丙二醛(MDA)与羰基含量低于对照.盐胁迫下转基因大麦幼苗叶片的过氧化物歧化酶(SOD)活性与过氧化氢酶(CAT)活性普遍高于对照.转基因大麦类囊体中铁蛋白大量积累的持续时间比对照长.由此可以推测,Trxs至少可以通过两条途径缓解盐胁迫对大麦幼苗生长的抑制作用:一方面增强抗氧化酶活性、有效清除过量产生的活性氧;另一方面能促进铁蛋白含量的增加、抑制Fenton反应来减少活性氧的过量产生,从而赋予转基因大麦幼苗更强的抗盐胁迫能力.     

改良CTAB法在核桃叶片基因组DNA提取中的应用研究

核桃叶片中酚类、多糖和蛋白含量丰富,影响了基因组DNA的提取。以CTAB法为基础进行了改良,并对核桃叶片基因组DNA进行提取。结果表明,通过在研磨时添加PVPP后的改良CTAB法不仅操作简单,经济高效,而且去除多糖和多酚类物质彻底,能成功用于核桃的基因克隆研究,在核桃DNA提取中值得大力推广使用。     

反义TrxS基因在小麦中的表达及对小麦种子蛋白酶活性和蛋白组分的影响

为了揭示反义硫氧还蛋白基因(anti-TrxS)在抗穗发芽小麦中的作用机制,探讨转基因小麦中蛋白酶活性和蛋白组分的变化规律,以转反义TrxS基因小麦株系为材料,用荧光定量RT-PCR、SDS-PAGE和生理指标测定的方法,对转基因株系和对照种子萌发过程中反义TrxS基因表达、蛋白酶活性和蛋白组分进行了检测。结果表明,反义TrxS基因在RNA水平上能够表达;转基因小麦籽粒蛋白酶活性明显下降,种子吸涨12、24、48、729、6和120 h后,转基因小麦种子蛋白酶活性比对照分别降低27.3%、30.7%、19.1%、19.4%、23.7%和13.5%;转基因小麦籽粒谷蛋白、醇溶蛋白的SDS-PAGE分析表明,反义TrxS基因的导入抑制了转基因小麦籽粒谷蛋白和醇溶蛋白大分子亚基二硫键(S-S)向巯基(-SH)的转化,从而使蛋白质的降解延缓。     

Trxs基因对啤酒大麦籽粒灌浆后期抗氧化能力和荧光参数的影响

为了深入探索Trxs基因的功能,给转基因大麦育种提供理论依据,以啤酒大麦品种Harrington及其过量表达硫氧还蛋白S基因(Trxs)的转基因大麦株系为试验材料,对籽粒灌浆后期旗叶中还原型谷胱甘肽(GSH)含量、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、叶绿素荧光特性以及不同发育阶段籽粒中GSH含量和产量性状进行研究.结果显示:(1)籽粒灌浆后期转基因大麦旗叶GSH含量与APX活性显著高于非转基因对照;(2)花后15 d时各测定时间点和籽粒灌浆后期不同测定时间转基因大麦旗叶叶绿素荧光参数Fv/Fm与Fv/Fo值普遍高于对照;(3)转基因大麦的产量性状优于对照,其千粒重、单株穗数和单株产量平均分别比对照提高了12.29%、34.34%与41.01%.这些结果表明,Trxs通过影响旗叶和籽粒中GSH含量和旗叶中APX活性,提高了籽粒灌浆后期转基因啤酒大麦抗逆境胁迫的能力,改善了啤酒大麦转基因株系在籽粒灌浆后期的光合性能,有利于提高了单株产量.     

马铃薯C-8,7甾醇异构酶基因(StSI1) cDNA克隆及表达

 以拟南芥C-8, 7甾醇异构酶的氨基酸序列为信息探针搜索GenBank数据库, 对高度同源的马铃薯EST序列进行拼接、引物设计和RT2PCR扩增, 扩增产物测序结果证实获得一个马铃薯C-8, 7甾醇异构酶基因(StSI1) 的全长cDNA序列。序列分析结果显示, StSI1全长886 bp, 包含59 bp的5′非编码序列、161 bp的3′非编码序列和一个长度为666 bp编码221个氨基酸的开放阅读框, 分子量约为25 kD。氨基酸结构分析显示该蛋白的N端含有一个长度由35个氨基酸残基组成的信号肽, C端成熟肽区域含有典型的类EBP结合域。氨基酸比对分析表明, StSI1与已知C-8,7甾醇异构酶同源性介于32.9% ～61.3%之间, 与拟南芥AtSI1相似性最(61.3% ) 。RT-PCR 表达谱分析显示, StSI1在马铃薯的块茎芽眼和表皮组织中均能表达, 并且该基因的表达水平受贮藏温度升高和光照增强的正向调节。     

小麦16.9 kD热激蛋白cDNA克隆及其表达分析

为进一步了解小分子量热激蛋白在小麦耐热能力中的作用,根据玉米16.9 kD小分子热激蛋白的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,用RT-PCR扩增获得了1个源自小麦叶片的热激蛋白基因cDNA片段,即TaHSP16.9-1(GenBank登录号为EU649679).TaHSP16.9-1全长770 bp,5′非翻译区81 bp,3′非翻译区233 bp,开放阅读框编码151个氨基酸.序列分析结果表明,此蛋白与已知单子叶植物来源的同类基因高度同源,相似性介于78.3%～96.7%之间.定量RT-PCR表达谱分析显示,TaHSP16.9-1在小麦抽穗期的茎和旗叶以及幼苗期叶片中均能表达,其在小麦幼苗叶片中的表达受高温胁迫的诱导.     

大麦衔接蛋白AP 3复合体 HvMu3 基因的克隆及表达分析

为研究大麦衔接蛋白AP-3复合体的功能,根据Mu3亚基的保守氨基酸序列,借助生物信息学搜索大麦EST序列,拼接了一个大麦(Hordeum vulgare)衔接蛋白AP-3复合体Mu3亚基基因(HvMu3),以大麦叶片来源的DNA做为模板,采用RT PCR扩增HvMu3基因.采用半定量RT-PCR及荧光定量PCR(qRT-PCR)对该基因的组织表达特性以及ABA、NaCl和Cr6+胁迫条件下的表达模式进行分析.结果表明,HvMu3完整阅读框全长为4 439 bp,包含8外显子和7内含子,编码417个氨基酸残基,其中含有1个MHD结构域,属于衔接蛋白AP-3复合体Mu3亚基的典型特征,是首次克隆获得大麦衔接蛋白AP-3复合体Mu3亚基基因HvMu3;HvMu3在供试样品的根、茎、叶、胚和胚乳中均能表达,以胚中表达量最高,根、茎和叶次之,胚乳中表达量最低,表明该基因在大麦的旺盛生长组织中表达强烈;HvMu3在大麦幼苗叶片中的表达受ABA、NaCl和Cr6+胁迫诱导,推测其在大麦的生长发育和抵抗逆境胁迫过程中发挥重要作用.     

REC法鉴定黄淮麦区15个小麦品种的耐热性

以生长10d的小麦幼苗为材料,通过测定热胁迫处理前后叶片相对电导率（REC）的变化鉴定其耐热挂。结果表明,15个供试小麦品种中,周麦16、豫麦49—198等6个品种为耐热品种,豫麦70、周麦19等8个品种为热敏感品种。     

小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析,探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能,为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针,对小麦EST数据库进行搜索,筛选与探针同源性在97％以上的EST序列,通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长,采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征;采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树;将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X,重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导1-5 h后,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列,命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1 356 bp,包含一个1 209 bp的开放阅读框（ORF）,5′端非编码区50 bp,3′端非编码区97 bp,编码402个氨基酸,推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD,等电点为4.30,属于酸性蛋白,BLAST分析表明,该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域,称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明,TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近,二者具有高度的同源性,其编码的氨基酸一致性达到91%;蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键,亚细胞定位于细胞质中;成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1,在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白,与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析,显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达,其中在幼穗中表达量最高,在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达;干旱胁迫过程中,TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势;高温和低温胁迫过程中,TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达,分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列,其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域;在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下,TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络,可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。