刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达

亲环蛋白（cyclophilin,CyP）是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫（Toxoplasmngondii）速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用。本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHI和EcoRI酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因。PCR产物连接到pMD18-T克隆载体。用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAXI,构建真核表达质粒pVAXl-TgCyP。将真核表达质粒转染Hela细胞,利用问接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况。结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列（U04633．1）的一致性达100％,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性。本研究表明Tg-CyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础。     

微小隐孢子虫微线蛋白GP900与MDBK细胞互作蛋白的筛选

通过筛选与微小隐孢子虫微线蛋白GP900相互作用的MDBK细胞蛋白,为进一步揭示微小隐孢子虫入侵宿主细胞的分子机制提供依据。首先构建重组原核表达质粒pGEX-4T-GP900,表达并纯化重组GP900蛋白;然后将重组GP900蛋白与MDBK细胞裂解液孵育,免疫共沉淀获得结合蛋白,质谱法分析与GP900互作的蛋白;最后用酵母双杂交进行验证。结果表明,成功构建pGEX-4T-GP900表达质粒,并纯化获得大小为43 kDa的重组GP900蛋白;免疫沉淀-质谱法筛选到2种与GP900相互作用的MDBK细胞蛋白,分别为膜联蛋白A2和热休克蛋白5;酵母双杂交技术验证了GP900与以上2种蛋白均有相互作用。为进一步阐明微小隐孢子虫入侵宿主细胞的分子机制奠定了基础。     

刚地弓形虫RH株SAG3蛋白抗体检测的ELISA方法建立

[目的]利用纯化的刚地弓形虫RH株表面蛋白SAG3的原核重组蛋白为基础,建立抗体间接ELISA检测方法。[方法]采用棋盘滴定法,确定间接ELISA的最佳条件。采用鼠抗新孢子虫阳性血清、鼠抗安氏隐孢子虫阳性血清、鼠抗柔嫩艾美尔球虫阳性血清、鼠抗蓝氏贾第虫阳性血清以及鼠抗微小隐孢子虫阳性血清和健康小鼠阴性血清作对照,检测血清之间是否有交叉反应。[结果]最佳包被条件为:抗原包被浓度0.25μg/孔,被检血清稀释度1∶400,酶标二抗稀释度1∶3 000,封闭剂5%脱脂奶粉的PBST溶液;血清之间没有交叉反应。该方法的灵敏度为1∶1 600。[结论]该方法灵敏度高,特异性较强,可重复性较好,可用于对弓形虫感染的检测及流行病学调查。     

旋毛虫肌幼虫总RNA提取方法研究初报

【研究目的】探索高质量的旋毛虫(Trichinella spiralis)肌幼虫总RNA提取方法;【方法】利用Trizol试剂采用三种方法提取旋毛虫肌幼虫总RNA。(1)液氮预冷的研钵中研磨新鲜虫体至样品快融化时,加入适量的Trizol,继续研磨至液状后转移到离心管中;(2)A将新分离的虫体放到-20℃预冷的研钵中,在研磨过程中不断地添加液氮以保持虫体冷冻,之后对冷冻状的样品粉末继续操作;B把液氮冻存的新鲜旋毛虫肌幼虫取出,放到-20℃预冷的研钵中重复A的操作;(3)新鲜虫体放入匀浆器中,加适量Trizol,在冰水混合物中研磨20分钟。虫体破碎后按Trizol说明书继续抽提。最后通过凝胶电泳和紫外吸收光度值检测。【结果】用液氮和Trizol结合的方法,使用新鲜样品提取旋毛虫肌幼虫总RNA,在纯度和得率上都较为理想;【结论】使用新鲜的样品,且液氮与裂解液结合,是获得高质量RNA的可行方法。     

柔嫩艾美耳球虫rhomboid抗原基因在卡介苗中的克隆与表达

以含柔嫩艾美耳球虫rhomboid基因的重组质粒为模板,应用PCR方法扩增该基因完整开放阅读框,克隆至pMD18-T载体中.分别用限制性内切酶Pst I/Cla I和Pvu II/Cla I进行双酶切,将rhomboid目的基因克隆到大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,获得重组质粒pRho-261和pRho-361.将重组质粒电穿孔转化卡介苗,经热诱导后对其表达产物进行SDS-PAGE和western blot分析.结果表明成功构建了两个重组质粒,其表达产物与柔嫩艾美耳球虫阳性血清具有免疫反应性,为重组卡介苗在鸡球虫病防治方面的研究奠定了基础.     

E.tenella吉林株单卵囊的分离及PCR鉴定

[目的]为了获得E．tenella纯株,进行相关的分子生物学研究。[方法]对已经建立的球虫单卵囊分离技术进行改进,用分离的单卵囊胶囊接种雏鸡。同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定。[结果]20只试验鸡中有15只粪便中分离到卵囊,感染成功率为75％。PCR扩增结果表明该单卵囊分离株为Etenella。[结论]采用单卵囊胶囊进行接种,操作简便,既节省了接种时间,又降低了接种难度,且大大提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究提供了材料。     

人乳腺癌细胞、结肠癌细胞和宫颈癌细胞生长曲线测定

为检测比较人乳腺细胞(MDA-MB-231、MCF-7、HBL-100)、人结肠癌细胞(HCT-8)和人宫颈癌细胞(HeLa)生长曲线的差异性.本实验首先常规培养MDA-MB-231、MCF-7、HBL-100、HCT-8和HeLa细胞,然后应用MTT方法测定这几种细胞的生长曲线.在本实验条件下,这几种细胞生长速度从高...     

人工感染犬贾第虫包囊排出规律的观察

用犬贾第虫滋养体感染试验幼犬后进行粪便检查,结果表明,滋养体可以感染试验幼犬,且包囊排出规律呈间歇性,其间歇期为7～8 d,第3天开始排出包囊,排囊后第10天达到高峰期,高峰期持续3～4 d,在间歇期持续排出少量包囊。感染试验犬有腹泻,厌食,体重减轻等症状。     

猪三毛滴虫长春株不同染色方法的比较

将从长春地区腹泻仔猪盲肠中分离得到的猪三毛滴虫用1640培养基短期培养后,使用碘染色法、瑞氏染色法、姬氏染色法、姬氏-瑞氏复染法、Weigere铁苏木素染色法和鞭毛染色法染色分别对其染色,观察不同虫体形态结构,并比较了不同染色方法的染色效果。结果显示,姬氏染色、瑞氏-姬氏复染和鞭毛染色法对猪三毛滴虫染色效果较好,可获得虫体形态完整、结构清晰的染色标本。     

斯氏艾美耳球虫ADF基因部分序列的克隆与分析

为了获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因并分析其与柔嫩艾美耳球虫长春株相应序列的同源性,试验根据GenBank中公布的柔嫩艾美耳球虫ADF基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得我国斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因部分序列,然后将其克隆到pMD18-T载体中,应用DNAStar软件对测得序列进行序列分析。结果表明:斯氏艾美耳球虫长春株ADF基因大小为357 bp;经DNAStar分析,我国斯氏艾美耳球虫长春株与柔嫩艾美耳球虫长春株ADF核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99.2%。说明ADF基因在进化过程中高度保守。