新城疫病毒血凝素蛋白RNA适配体的筛选及活性研究

核酸适配体与单克隆抗体相比具有更高的分辨率,能识别配体间一个基团的细微差别,且所需的结合活性位点更小。本试验通过SELEX技术,体外经过12轮筛选获得了能够与F48E9株新城疫病毒特异性结合的3个RNA适配体,命名为FHN12-45-3、FHN12-36-6和FHN12-19-9。RNA适配体的二级机构预测结果显示,所筛选获得的RNA适配体空间结构以外环、内环、发夹环及突起结构为主。特异性试验结果显示,适配体FHN12-45-3经ELISA和Dot-blot试验证实能够区分不同株的新城疫病毒。生物学活性试验结果显示,适配体FHN12-45-3能够减少4个单位的F48E9株病毒血凝效价,初步表明适配体与F48E9株病毒可能的活性作用位点在血凝素蛋白上,在鸡胚成纤维细胞培养体系中适配体FHN12-45-3能够减少84.62%的F48E9株病毒蚀斑,荧光定量RT-PCR方法检测适配体FHN12-45-3能够减少培养体系中77.73%病毒载量,表明筛选的RNA适配体在细胞水平能够有效的抑制F48E9株新城疫病毒的复制。     

细胞表面糖链类型鉴定及其与副粘病毒结合的特异性

通过糖链检测试剂盒对Vero细胞进行细胞凝集素组织化学染色鉴定,结果显示,Vero细胞与凝集素MAA和SNA呈强阳性反应,而与凝集素GNA和PNA呈阴性反应,表明Vero细胞表面具有唾液酸α2-3连接的半乳糖和唾液酸α2-6连接的半乳糖。Vero细胞神经节苷脂提取及纯化结果显示,GD1a是主要神经节苷脂组分,同时还存在GM1、GM2和GM3。为进一步确定神经节苷脂在病毒入侵中的作用和意义,使用神经节苷脂标准品及Vero细胞神经节苷脂提取物对新城疫病毒和鹅副粘病毒分别进行红细胞吸附抑制试验,结果表明,2种病毒与不同类型神经节苷脂结合特异性上存在差异。     

4种蛙皮肤活性肽的提取及生物活性比较

利用80%甲醇和乙醚刺激方法,分别提取了4种两栖类动物皮肤粗提物和分泌物,并进行了生物学活性的测定.结果表明,4种蛙皮肤粗提物具有广谱抗菌活性,其中中国林蛙有轻微的溶血性,牛蛙与美国青蛙粗提物具有胰蛋白酶抑制剂活性;而4种蛙皮肤粗提物均无胰蛋白酶活性,牛蛙、美国青蛙与东北林蛙具有很强的凝集素活性.利用MTT法检测到4种蛙皮粗提物具有抗肿瘤细胞与抗病毒活性.     

基于B细胞表位肽的水貂阿留申病毒抗体ELISA检测方法的建立及其在流行病学调查中的应用

为建立水貂阿留申病(AD)抗体间接ELISA检测方法,本研究通过生物信息学预测筛选多个阿留申病毒(ADV)VP2结构蛋白保守的B细胞表位,设计人工诊断抗原肽SD,经原核表达、纯化后作为ELISA的包被抗原,建立了间接ELISA检测方法。结果显示该方法特异性好、敏感性高,与对流免疫电泳(CIEP)方法的符合率达93.2%。利用该方法对我国主要养貂区域的2190份血清样品进行AD血清学调查,结果显示山东、大连、河南、吉林、黑龙江AD阳性率分别为80.41%、82.14%、69.81%、71.24%、78.41%,表明AD在我国已呈高发态势。本研究建立的ELISA方法显著提高了AD阳性检出率,对貂场AD的净化及养貂产业的健康发展具有重要意义。     

金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysK的表达及其多克隆抗体的制备

将噬菌体与细菌孵育25min提取噬菌体感染细菌的总RNA,通过逆转录的方法获得cDNA,以此为模板进行PCR扩增得到目的片段,以pET-15b为载体构建重组质粒pET-15b-lysK并转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达金黄色葡萄球菌噬菌体K裂解酶基因lysK,表达产物蛋白经镍柱纯化后,测定LysK的裂解活性、裂解谱,并免疫家兔制备多克隆抗体。结果表明,成功诱导表达可溶性LysK并获得重组蛋白,酶谱试验证明LysK对金黄色葡萄球菌具有裂解活性,LysK比噬菌体K裂解谱广。制备的兔多克隆抗体能够与LysK发生特异性反应且具有较高效价,为后续进行LysK体内治疗研究打下了基础。     

肝癌细胞靶向肽的筛选与鉴定

利用噬菌体环七肽库筛选与肝癌细胞特异性结合的多肽,并对其亲和力进行生物学鉴定。以HL-7702为消减细胞,HepG2为筛选靶细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮全细胞消减筛选,并随机挑取60个阳性噬菌体克隆,以ELISA法鉴定其与HepG2细胞的结合活性,并取阳性克隆进行测序分析,并合成多肽进行免疫细胞化学染色鉴定。经4轮筛选,噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集;利用ELISA从随机挑选的60个噬菌体克隆中得到15个与肝癌细胞具有高结合力的阳性克隆,测序并进行序列分析比对发现氨基酸序列无同源性,经免疫细胞化学染色鉴定后,发现1条多肽序列亲和力较高,为提高抗菌肽对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础。     

基因芯片检测细菌耐药基因

根据已知的耐药基因序列设计出检测四环素耐药基因特异探针7条、β-内酰胺类耐药基因特异探针5条,阳性坐标探针1条,长度为18-21 bp.根据探针序列两侧的保守区域设计了耐药基因扩增引物,引物长度17-20bp.通过荧光聚合酶链式反应,从耐药菌株中获得四环素耐药基因7个,β-内酰胺类耐药基因5个.经过芯片制作过程优化试验和芯片杂交优化试验,结果表明,将探针以终浓度30 μmol/L溶于50%DMSO中,在温度为20 C、湿度为70%的条件下点印于Aldehydeslide表面.扩增出的荧光标记产物经纯化后与2×杂交液混合,再与基因芯片在42 C杂交5 h可检测到理想的杂交信号.芯片灵敏度试验结果表明,当模板拷贝数大于1×103个/μL时,可检测到较强的杂交信号.本试验最终研制出灵敏度高、特异性强的耐药基因检测芯片.     

新发反刍动物传染病——施马伦贝格病研究进展

2011年11月在德国西部城镇施马伦贝格镇牛场中发现一种未知的,主要感染绵羊、山羊、牛等反刍动物的新型病毒性动物传染疾病。感染动物出现高烧达40℃、精神不振、产奶严重下降、多功能衰竭、腹泻、厌食、怀孕母畜流产、死胎或畸形等临床症状。德国研究人员利用分离的病毒进行鉴定证实该病毒为一种新型布尼亚病毒,被命名为施马伦贝格病毒（Schmallenberg virus,SBV）。     

33株临床分离菌的药敏试验分析

收集标准菌株2株和临床分离菌株共33株,采用NCCLS推荐的微量稀释法测定6种抗生素对33株病原菌的最低抑菌浓度.33株临床分离菌株对临床上常用的6种抗生素的平均敏感率为27.7%,平均耐药率为64.8%.对金黄色葡萄球菌抗茵作用最强的是氯霉素,敏感率为82.6%,MIC50为2 mg/L,MIC90为64 mg/L;耐药性最强的是青霉素,耐药率达100%.肺炎克雷伯菌的耐药性较为严重,平均耐药率高达80%,抗茵作用最强的为新霉素,但其敏感率仅为40%.33株临床分离菌株的耐药性较为严重,存在交叉耐药性和多重耐药性现象.     

福州3个鲜食橄榄品种(系)的氨基酸组成与品质评价

为研究橄榄鲜食品种(系)的氨基酸组成和营养品质,试验以福州主栽的灵峰、闽清2号和清榄1号橄榄为材料进行氨基酸含量测定,并对其进行营养和品质风味评价。结果发现,灵峰的总氨基酸含量最高,达到20.078 mg.g_–1,而清榄1号的必需氨基酸含量最均衡。在各类氨基酸中,谷氨酸和天门冬氨酸为3种橄榄鲜食品种(系)的主要氨基酸,苏氨酸和赖氨酸的含量相对过剩,而甲硫氨酸和半胱氨酸可能为第一限制氨基酸;在橄榄特征风味形成过程中,组氨酸、丙氨酸和赖氨酸均会影响鲜食橄榄甜味的形成,精氨酸对苦味的形成存在较高的贡献率,天门冬氨酸和谷氨酸的大量存在可能是其鲜味形成的重要原因之一。此外,灵峰的药用氨基酸组分含量最多,达到13.94 mg.g_–1。研究认为,不同橄榄鲜食品种(系)的氨基酸营养和风味品质存在差异,而药用氨基酸可能是橄榄的重要功能成分之一。