绞股蓝RIP基因双子叶植物表达载体的构建及其对烟草叶盘的转化

将绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(Ribosome-Inactivating Protein,RIP)cDNA序列(GenBank登录号AY279219)插入到pKYLX71:35 S^2植物表达载体的HindⅢ/SacI位点处,构建了适于在双子叶植物中表达的载体,并经三亲交配法转入土壤农杆菌LBA4404,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录。     

绞股蓝核糖体失活蛋白的分离、克隆与表达

核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)具有抗肿瘤和抗病毒等医用价值,以及抗植物病毒和病原真菌等农用价值.它是一种多活性的物质,不同RIP具有各自独特的功能,其潜在活性还在不断发现之中.葫芦科(Cucurbitaceae)植物大多药食同源,其中蕴涵着极其多样的RIP,但多数已知的RIP其基因尚未被克隆,而目前仍无一套快速筛选RIP新基因的方法.葫芦科中的绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)具有抗癌和抗衰老等特殊功效,其中的皂甙和黄酮成分的研究已有大量报道,但其活性蛋白成分未见报道.为此,本研究开展绞股蓝RIP的分离纯化、基因克隆、原核表达以及转基因植物研究.率先对绞股蓝活性蛋白成分进行研究,从中分离到一种新的核糖体失活蛋白(绞股蓝毒蛋白,Gynostemmin).它具有很高的抗TMV活性.其分子量约为27 kDa.测得其N-端19个氨基酸序列:DINFSLAGADGQTYNTFIA,与其它植物RIP的同源性为10%-73%,与葫芦科RIP的同源性为37%-73%.根据葫芦科RIP上、下游两段高度保守的氨基酸序列设计简并引物对LY1/LY2,对基因组DNA进行PCR扩增,首次建立了RIP新基因快速筛选体系.从冬瓜和南瓜中分别获得了1个和5个RIP新基因,长度为408 bp,编码136 aa,与其它葫芦科RIP对应区段的同源性约为35%-85%.比较发现,19个葫芦科RIP的LY1/LY2区段上完全相同的氨基酸有29个,其中7个在其它科属来源的RIP中也完全保守,包括构成活性中心的3个残基E160、R163和W192.根据LY1/LY2区段同源性构建的系统进化树表明,葫芦科RIP之间的进化关系与其来源植物间的亲源关系大体一致.通过DNA片段克隆、RACE扩增、cDNA克隆和DNA克隆,从绞股蓝中分离了13个RIP基因,其中10个为cDNA序列,3个是DNA序列(GP609、DNA-750和DNA-8001).它们之间在碱基水平和氨基酸水平上的同源性都很高,可根据序列上发生缺失的有无及其类型将其分为4组:组1,发生6 bp缺失(535 GAAAAC 540,与574-579间的序列完全一样),包括GynostemminII、GP609和CX8405A,编码275 aa;组2,缺失87 bp(122-208),包括DNA-750和CX820,编码248 aa;组3,包括5RACE和DNA-8001,不发生组2的87 bp缺失,但因其序列较短,无法确认是否具备组1的6 bp缺失;组4,包括GynostemminI、III、IV、V以及EMUZW和RHXJB,既无87 bp缺失也不发生6 bp缺失,编码277 aa.其中GP609与其它葫芦科RIP的LY1/LY2区段的同源性,碱基水平为47%-61%,氨基酸水平为37%-49%.5RACE中包含了由23 aa组成的信号肽“MRVARFCTVVAILLYFGFHIAEC“,同时包含有5UTR序列,其中含有kozak序列“AAAAAA“.对绞股蓝RIP基因家族及其编码氨基酸进行的比较分析发现,绞股蓝RIP前体成熟过程中可能发生C-末端切除,并因此造成等电点从弱酸性跃迁至强碱性,这种现象以前未见报道.分析结果进一步支持了RIP基因无内含子的观点.5个含有3UTR的成员中,GynostemminI 比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件ARE(AU-rich element),其mRNA的稳定性可能因此受到影响.运用生物信息学软件对绞股蓝RIP前体进行碱基组成和密码子偏倚性、氨基酸组成特征、功能位点、亚细胞定位、跨膜结构、核酸结合基序以及空间结构等方面的分析.分别将GP609和RHXJB转入pGEX-2T融合表达载体,在大肠杆菌DH5α菌株中实现融合表达.将DNA-8001连接到pET-5a表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中实现天然表达,表达产物对TMV的抑制效果很差,其原因可能是C-末端延伸序列的存在抑制了抗TMV活性的发挥.分别构建了含有GP609和EMUZW的pEmu-mcs-N植物表达载体,同时构建了含有RHXJB的pKYLX71∶35S2植物表达载体(ZW-pK).采用三亲交配法将ZW-pK转入土壤农杆菌LBA4404中,用于转化烟草品种K-326,分子鉴定表明绞股蓝RIP基因已经整合到再生烟苗的基因组中并发生了转录.重点讨论了绞股蓝RIP的应用前景、RIP基因的内含子、以及RIP的C-末端及其延伸序列的修饰和功能等方面的问题.研究结果为绞股蓝RIP的开发利用奠定了坚实基础,并对探讨其酶学活性、生理功能以及抗病毒机理等RIP研究的难点和热点问题具有一定的指导意义.     

PEG模拟干旱胁迫对石斛DNA表观遗传变化的MSAP分析

利用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术,研究不同聚乙二醇(PEG-6000)处理浓度下霍山石斛基因组DNA的甲基化水平和变化模式.结果表明:经5%、10%和15%PEG-6000处理的霍山石斛DNA甲基化比率分别为34....     

强光胁迫下外源NO对霍山石斛叶绿素荧光的影响

以兼性景天酸代谢CAM植物霍山石斛为材料,研究了强光胁迫条件下,外源一氧化氮(NO)对霍山石斛叶绿素荧光参数的影响。结果表明:在强光胁迫下,0.1mmol/L硝普钠(SNP,NO供体)处理显著缓解强光对霍山石斛光合系统Ⅱ(PSⅡ)的抑制,霍山石斛PSⅡ荧光参数潜在光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学猝灭系数qL、非光化学猝灭系数NPQ和ΦNPQ下降缓慢,且非光化学猝灭系数ΦNO值较低,PSⅡ反应中心恢复较快,说明该处理缓解了光抑制的发生,保护了光合机构免受强光胁迫的伤害,而经0.5mmol/L SNP处理后,霍山石斛的Fv/Fm、ΦpsⅡ、qL、NPQ和ΦNPQ下降程度增加,ΦNO也较高,恢复较慢,表明该处理加剧了PSⅡ反应中心光抑制的发生。可见,高浓度(0.5mmol/L)SNP处理可加剧光抑制的发生,而低浓度(0.1mmol/L)SNP处理可缓解强光对石斛的胁迫作用。     

霍山石斛类原球茎诱导及其发育过程研究

 以霍山石斛试管苗带节茎段为材料, 诱导产生类原球茎, 并研究类原球茎发育过程。结果表 明, 霍山石斛类原球茎诱导的适宜培养基为Knudson + 2, 4-D 0.1 mg·L ^{- 1} + KT 0.05 mg·L ^{- 1} , 诱导率为25.50%。以固体静置、固液双层静置、液体静置、液体振荡4种不同培养方式进行增殖培养, 其中液体振荡培养方式更适于类原球茎快速增殖。类原球茎通过胚状体发生途径形成, 类似于合子胚的发育, 即经历原胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶胚, 最后发育为成熟胚。类原球茎发育进程大致可分为类原球茎形成期、类原球茎肥大期、茎叶分化期、茎叶形成期以及茎叶伸长期等阶段。     

电转化法及其在苏云金杆菌中的应用

苏云金杆菌（ Ｂｔ）工程菌的构建,可以采用原生质体融合、接合转移和转化等方法,其中电转化法被公认为是最有效的手段之一,此技术已广泛地应用于 Ｂｔ的遗传改良．本文阐述了电转化基本原理及基本操作步骤．此外,还就存在的问题和应用前景进行探讨     

几种蔷薇和‘月月粉’与现代月季杂交亲和性评价

以报春刺玫、单瓣黄刺玫、‘月月粉’和疏花蔷薇等抗性强、早花的蔷薇属资源作为父本,以大田栽培的现代月季作为母本进行杂交育种试验。结合前期育种工作,筛选出杂交亲和的组合有22个：‘Eyeopener’×报春刺玫、‘Berk Shire’×单瓣黄刺玫、‘Sally Holmes’×单瓣黄刺玫、‘Partidge’×单瓣黄刺玫、‘Partidge’×报春刺玫、‘Partidge’ב月月粉’、 ‘Partidge’×疏花蔷薇、‘Cambridgeshire’×单瓣黄刺玫、‘Robin Redbreast’×报春刺玫、‘Summer Sunrise’×报春刺玫、‘Tess of The Durbervilles’×报春刺玫、‘Petal Pushers’×报春刺玫、‘Laura Ford ×单瓣黄刺玫、‘Jill Dando ×单瓣黄刺玫、‘Jill Dando ×报春刺玫、‘Twenty\|fifth ×报春刺玫、‘Phea Sant ×报春刺玫、‘Grouse ×单瓣黄刺玫、‘Grouse ×报春刺玫、‘Summer Sunset’×单瓣黄刺玫、‘Anna Zinkeisen ×单瓣黄刺玫、‘Anna Zinkeisen ×疏花蔷薇。     

响应面法优化番木瓜渗透脱水工艺

以糖液浓度(40%~60%)、渗透脱水温度(30℃~60℃)和浸渍时间(2~8 h)为因素,以失水率(WL)和固形物增加率(SG)为响应变量,采用响应面法优化番木瓜的渗透脱水条件。根据响应面(Box-Behnken)试验设计进行试验,以失水率最大和固形物增加率最小为指标对渗透脱水过程进行优化。结果表明,番木瓜渗透脱水的最佳工艺参数为:糖液浓度60%、温度52.95℃、浸渍时间7.33 h。     

乌骨鸡烟曲霉菌病的诊断

１９９７年７－８月间,成都某大型乌骨鸡场发生了一种以呼吸困难,在肺和气囊处形成肉芽肿结节为主要特征的疫病。经临床、病理剖检及实验室检查等综合诊断,确诊为鸡烟曲霉菌病。现将诊疗情况报告如下：１发病情况该场从７月份起,在２－１２０日龄六批鸡群中出现呼吸...