皮革肾岛衣一个聚酮合酶基因的克隆与鉴定

通过对地衣型真菌皮革肾岛衣转录组数据的分析,挖掘出1条非还原型聚酮合酶基因,通过RT-PCR首次克隆得到该基因的cDNA全长(NpPKS2),并通过生物信息学手段分析其基因和蛋白氨基酸序列,采用荧光定量PCR技术分析该基因在不同培养基上的表达情况.结果显示:NpPKS2基因全长6 249 bp,编码2 082个氨基酸;生物信息学分析显示该基因编码1种非还原型聚酮合酶,结构域顺序为SAT-KS-AT-PT-ACP-TE,根据聚类分析和结构域分析,推断NpPKS2为苔色酸合成酶;荧光定量分析显示地衣型真菌皮革肾岛衣中的NpPKS2基因用BMG培养基培养时表达量最高.     

基于全基因组牛樟芝中萜烯合成酶的鉴定与表达分析

萜烯合成酶(terpene synthases, TPS)是一类异戊二烯环化酶,是真菌萜类化合物生物合成的关键酶之一。为深入了解牛樟芝的萜烯合成酶基因功能,本研究利用BLAST比对获得14个牛樟芝萜烯合成酶(AcTPS)基因,并通过生物信息学方法对其产物蛋白进行功能预测,利用半定量PCR分析不同碳氮源培养基对牛樟芝萜烯合成酶基因表达的影响。结果表明,14个AcTPS蛋白的氨基酸数量为317～2 693个;理论等电点平均pI值为5.96,有6个蛋白(AcTPS6, Ac TPS9, AcTPS10, AcTPS11, AcTPS13, AcTPS14)不稳定系数>40,均为不稳定蛋白;AcTPS12脂肪系数>100,为疏水性蛋白。基因表达谱数据显示,10个牛樟芝萜烯合成酶有6个基因在不同培养基上表达量差异显著,其中AcTPS7只在葡萄糖和土豆蛋白胨培养基中表达,AcTPS10在葡萄糖培养基的表达量高,AcTPS3、AcTPS8及AcTPS6在番茄浸粉培养基中表达量显著,AcTPS2在麦芽浸粉培养基中表达量较高,推测不同培养基能够调控牛樟芝萜烯合成酶的表达。本研究结果为深入研究...     

蒜头果叶绿体基因组密码子偏好性分析

为了解蒜头果叶绿体基因组密码子的使用偏性,利用Codon W 1.4.2和CUSP软件对蒜头果叶绿体基因组中33个基因的密码子进行中性绘图,应用ENC−plot、PR2−plot绘图分析并确定了其最优密码子。结果表明：蒜头果叶绿体基因组密码子的第3位碱基GC含量为28.43%,远低于第1位（47.74%）和第2位（41.05%）,RSCU值大于1的密码子有30个,其中12个以A结尾,16个以U结尾,说明蒜头果叶绿体基因组的编码基因偏好以A和U结尾。GC₁₂和GC₃的相关系数为0.1646,相关性不显著,回归系数为0.0004;有效密码子数（ENC）范围为40.39～54.86,大于45的有25个,ENC比值主要分布在−0.05～0.05之外。蒜头果叶绿体基因组中的大部分基因分布在PR2平面图的下半部或右下半部,说明蒜头果叶绿体基因组密码子偏好性更多地受选择的影响,同时亦受其他因素的影响。蒜头果叶绿体基因组的最优密码子确定为UUU、UUA、GUA等18个。     

滇牡丹(Paeonia delavayi)二氢黄酮醇4-还原酶基因的鉴定及表达

为了研究二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)对滇牡丹(Paeonia delavayi)花瓣中花色形成的作用,本研究采用RT-PCR技术首次从滇牡丹中克隆得到一个具有完整开放阅读框的二氢黄酮醇4-还原酶基因(PdDFR),生物信息学分析和转录模式分析显示,该基因全长1 050 bp,共编码349个氨基酸,其蛋白序列与黄牡丹(Paeonia lutea) DFR的蛋白序列具有99.00%的一致性。序列比对分析显示PdDFR基因存在一个由21个氨基酸组成的NADPH结合位点"VTGATGYIGSWLVKTLLERGN"。滇牡丹PdDFR蛋白与黄牡丹(Paeonia lutea, ALX35996.1)、蓖麻(Ricinus communis, XP015577076.1)、木薯(Manihot esculenta, XP021607-041.1)的DFR蛋白聚为一类;转录模式分析表明PdDFR基因在红色花瓣中有表达,在根、茎、叶中不表达。本研究通过对滇牡丹转录组数据的分析,分离并克隆得到PdDFR基因,为利用基因工程技术选育优良滇牡丹花卉品种提供理论参考。     

岩生树花地衣型真菌NRPS基因的生物信息学分析

为了挖掘岩生树花地衣型真菌转录组数据中的NRPS基因,找出其潜在化合物或蛋白,以岩生树花地衣型真菌的转录组数据为基础,分析获得一个新的NRPS基因(Ri NRPS)。利用BLAST比对、分子系统进化及anti SMASH、NRPS predictor、Na PDo S、Norine等生物信息学分析手段对岩生树花地衣型真菌Ri NRPS基因进行分析,结果显示,Ri NRPS基因相对分子质量为702 699.9,等电点5.83,为不稳定蛋白;其开放阅读框总长19 098bp,编码6 362个氨基酸;该蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白,定位于细胞质基质中;可能合成HC-toxin合成酶,可能的催化反应是以Orn(鸟氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Gln(谷氨酰胺)、Cys(半胱氨酸)4个氨基酸作为底物合成环状四肽,此环状四肽可能是一种具毒素活性的多肽、其结构式为C21H32N4O6。研究结果为以后岩生树花NRPS基因的挖掘及非核糖体多肽类物质的生物合成提供参考。     

蒜头果中植物内生真菌烟曲霉的抗菌活性研究

植物内生真菌是一类生活在植物体内的微生物,能够产生化学结构新颖、生物活性多样的次生代谢产物。本研究用纸片法检测从我国特有植物蒜头果中分离得到的植物内生真菌烟曲霉的抗菌活性,并采用单菌多产物(OSMAC)策略寻找植物内生真菌烟曲霉产生抗菌化合物的最佳条件。结果表明:该烟曲霉液体发酵提取物对供试的6种人体致病细菌均有抑菌活性(蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、无乳链球菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌),其中对副溶血性弧菌、藤黄微球菌最低抑制浓度达到6.25mg/mL。以马铃薯粉为氮源,麦芽糖或葡萄糖为碳源,提取物得率较大且抑菌活性最好,接种量为60mg/100mL时提取物收获量最高。此外,改变培养温度能提高提取物对除无乳链球菌及藤黄微球菌以外的4种致病菌的抗菌活性。与细菌共培养后对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的抗菌活性有所增强,但对副溶血性弧菌、无乳链球菌、福氏志贺氏菌的抗菌活性下降。本研究为植物内生真菌抗菌化合物的开发利用奠定基础。     

滇牡丹中3个类查尔酮合成酶基因的克隆与表达

从开黄花的滇牡丹转录组中分离了3个CHS基因,利用生物信息学预测其基因功能,并比较不同花发育时期CHS基因的表达量。结果显示:3个CHS基因的cDNA全长分别为1 173、1 185、1 128 bp,依次命名为PdCHS1(GenBank登录号MK516264)、PdCHS2(GenBank登录号MK516265)和PdCHS3(GenBank登录号MK516266),分别编码390、394和375个氨基酸;这3个CHS基因编码的蛋白均为无信号肽的非分泌蛋白,均含查尔酮合成酶活性位点基序(G/A) FGPG。聚类结果显示,滇牡丹中的3个CHS蛋白归属于不同分支。基因表达结果显示,PdCHS1基因在花蕾期和花蕊中表达量较高,PdCHS2基因在末花期和初花期表达量较高,PdCHS3基因在末花期和花蕾期表达量较高。这3个CHS基因分别参与不同次生代谢产物的合成,推测PdCHS1参与柚皮素查尔酮,PdCHS2参与芪类化合物,PdCHS3参与聚酮类化合物的生物合成。     

基于转录组序列的非洲菊密码子偏好性分析

利用CodonW 1.4.2 和在线软件CUSP分析非洲菊转录组13769条编码序列的密码子碱基组成、同义密码子相对使用度和密码子偏好性,并通过中性绘图分析、ENC−plot和PR2−plot分析影响密码子偏好性的因素。结果表明：非洲菊编码基因序列的密码子偏好性整体偏弱,影响密码子偏好性的主要因素为突变,同时确定UUG、UUU、UAU、AUU、UGU、GUU、AGA、GGU、UCU、UCA、CCA、ACC、GCU等13个最优密码子,最优密码子偏好以A/U结尾。本研究为进一步明确非洲菊密码子进化特征和遗传转化中最优密码子的选择提供参考依据。     

滇牡丹3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆与功能分析

3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase,简称KCS)是超长链单不饱和脂肪酸生物合成途径的关键酶。依据转录组数据设计特异性引物,使用RT-PCR方法从滇牡丹(Paeonia delavayi)中克隆得到1个KCS基因的cDNA全长序列,命名为PdKCS(Gen Bank登录号KX524949)。生物信息学分析结果表明,PdKCS基因片段序列全长1527 bp,包含完整的cDNA开放阅读框(ORF),编码含有502个氨基酸残基的蛋白质;Blast比对结果显示,该蛋白质属于KCS蛋白家族;系统进化分析结果显示,该蛋白质属于跨膜、亲水性蛋白;RT-PCR结果显示,其在种子中的表达随着种子的成熟出现双峰型的表达量变化。研究结果可为进一步研究该蛋白的调控机制提供理论依据及获得含高不饱和脂肪酸转基因滇牡丹品种奠定理论基础。     

1个含有SDR结构域PKS/NRPS基因的克隆

聚酮和非核糖体多肽的复合化合物具有独特的生理活性,它们由聚酮合酶/非核糖体肽合成酶（PKS/NRPS）催化合成。目前球孢白僵菌Beauveria bassiana中含SDR结构域的PKS/NRPS酶的生物合成机制尚不清楚,采用基因挖掘技术从球孢白僵菌基因组中分离得到1个PKS/NRPS基因（命名Bbpks2）,利用生物信息学分析对其功能进行预测并检测该基因在以6.0 g·L-1麦芽提取物和3.0 g·L-1酵母提取物为基本氮源培养基,7种碳源添加物和以1.8 g·L-1麦芽糖和6.0 g·L-1葡萄糖为基本碳源培养基,4种氮源添加物培养基上的具体表达情况,其中每种添加物含量为4.0 g·L-1。结果显示:Bbpks2基因长度为12 051 bp,编码4 016个氨基酸;其结构域组织顺序为KS-AT-DH-MT-KR-ACP-C-A-PP-SDR,是一种含有SDR结构域的PKS/NRPS;系统进化分析发现,BbPKS2与球孢白僵菌JEF007菌株（PMB64475.1）、头状虫草Tolypocladium capitatum（PNY25600.1）等的PKS/NRPS蛋白聚在同个分支中,可能参与一种聚酮/非核糖体多肽类化合物的生物合成;比较不同氮源、碳源添加物对Bbpks2基因表达的影响,发现该基因在添加了乳糖的培养基上的表达量是其他碳源添加物的3.4倍以上,添加了牛肉浸粉的培养基上表达量是其他氮源添加物的1.3倍以上。该研究为下一步通过异源表达鉴定Bbpks2基因的具体功能,及其调控机理研究和基因资源利用奠定基础。